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酵母杂交技术 2016 7 相关知识 1 顺式作用元件 存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列 包括启动子 增强子 调控序列和可诱导元件等 作用是参与基因表达的调控 2 反式作用因子 转录因子 能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上 参与调控靶基因转录效率的蛋白质 3 报告基因 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因 4 cDNA文库 以mRNA为模板 反转录合成双链cDNA 各cDNA分子分别插入载体形成重组子 再导入宿主细胞克隆扩增 这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库 基本原理 真核生长转录因子含有两个结构上可以分开的 功能上也相互独立的结构域组成的结构域 转录激活结构域 AD activationdomain DNA结合结构域 BD DNAbindingdomain 转录激活因子 BD 识别DNA上特定序列 转录激活域定位调控基因的上游 AD 与转录复合体其他成分作用 从而启动所调节基因的转录 两个结构域分开时仍具有功能 但不能激活转录 只有他们以适当途径在空间上相互靠近时 才能具有转录因子活性 激活报告基因的表达 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报告基因的表达 探测蛋白 蛋白的相互作用 DNA结合域 DNA BD N端1 147氨基酸 可识别并结合酵母半乳糖苷酶的上游激活序列 UAS 转录激活域 AD C端786 881氨基酸 通过同转录机制的其它成分之间的结合以启动上游激活序列 UAS 下游的基因转录 酵母转录因子GAL4结构特点 酵母双杂交步骤 1 构建质粒 诱饵蛋白不发生自激活 2 转化酵母细胞 本身不表达GAL4 3 阳性筛选 1 1 BD plasmid靶基因 蛋白A基因 按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的BD之后 筛选标志 TRP 2 AD plasmid蛋白B基因按正确阅读框克隆到GAL4的AD片断之后 筛选标志 LEU2 1 双载体转化能合成亮氨酸和色氨酸 Trp Leu 2 两种重组质粒共同转化酵母菌 HF7c 3 筛选观察 2 筛选蛋白A和蛋白B能相互作用的双载体转化子 Trp Leu His 酵母细胞 cDNA文库 诱铒蛋白基因 多克隆位点 DNA BD载体 AD载体 转化 转化 酵母细胞 筛选平板生长菌苔 筛选平板生长菌苔 同一个三重筛选平板 克隆 诱饵与靶蛋白相互作用 鉴定 半乳糖苷酶 酵母双杂交系统的应用 1 发现新蛋白和蛋白的新功能 2 研究抗原和抗体的作用 细胞内 3 检测已知蛋白质之间的相互作用 4 确定未知蛋白之间的相互作用 5 确定基因治疗中多肽类药物的作用机理 应用举例 应用酵母双杂交筛选与FAM172A相互作用蛋白的研究 实验步骤 1 诱饵质粒构建 扩增诱饵蛋白基因 与质粒载体连接 重组载体鉴定 诱饵蛋白自我转录激活检测 将诱饵质粒转入酵母菌株 若转化了诱饵质粒的酵母菌落表达 半乳糖苷酶 则可使底物X Gal变蓝 说明存在自激活 假阳性 否则无自激活 2 人胎脑cDNA质粒构建 3 酵母双杂交筛选人胎脑cDNA文库 人胎脑cDNA文库转化诱饵酵母菌及初步筛选 菌液 分别涂布于培养基 A Leu Trp B Leu Trp His A平板上的克隆进行计数 根据稀释度计算转库效率 转库效率只有达到1X107 1X108cfu gDNA以上才能进行文库的筛选 以保证不会丢失阳性克隆 半乳糖苷酶克隆转移滤纸实验进一步筛选 从B Leu Trp His 平板上挑取35个单克隆进行 半乳糖苷酶克隆转移滤纸实验 变蓝色的为阳性克隆 3 阳性杂交克隆的质粒抽提及一对一验证 对上述筛选的阳性克隆进行质粒抽提 再次进行抗性筛选和质粒抽提后 一对一与诱饵质粒pGB FAM172A共转酵母细胞Y190验证 4 再次阳性者抽提质粒进行测序及生物信息学分析 利用NCBI对测序所得到的序列进行BLAST比对分析 结果 对10个阳性克隆相应的质粒进行测序后 通过BLAST在GenBank数据库中对应6个不同的基因 编码6种已知的蛋白质 RTCD1 MOCS2 A2M KCNIP1 BTBD2和TOX2 根据GenBank数据库及相关文献获得了它们的功能信息 其中A2M与糖尿病血管病变密切相关 也进一步提示FAM172A参与了糖尿病大血管病变的发病 1 用体内实验来研究蛋白质的相互作用 方法精确 不受外界影响 易于操作 2 所有操作均在核酸水平进行 无需纯化大量的蛋白质 可以精确测定蛋白质的弱相互作用 3 运用范围较大 酵母双杂交系统中的诱饵蛋白可以是完整的蛋白质 也可以是蛋白质的一个功能区 可以大到一个完整的肿瘤抑制蛋白 也可以小到一个约22个氨基酸的多肽 酵母双杂交系统的优点 局限性 1 它并非对所有蛋白质都适用 有其原理决定 融合蛋白的相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的 而表达的融合蛋白在细胞内能否正确折叠并运至核内是检测的前提条件 2 假阳性较多 某些诱饵蛋白具有自身激活性质 如AD融合靶蛋白有DNA的特异结合 则可单独激活报告基因的表达 双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验手段来验证 局限性 3 阴性干扰 两个蛋白本应发生相互作用 但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来 蛋白间的相互作用较弱 应选择高敏感的菌株或多拷贝载体 某些蛋白在酵母中不稳定表达或不能准确定位到胞核内 4 融合蛋白的表达对细胞有毒性 应选择敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体 在酵母双杂交的基础上 又发展出了酵母单杂交 酵母三杂交技术 它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究 三种不同蛋白之间的互作研究 酵母单杂交 酵母单杂交体系是借鉴酵母双杂交体系的基本原理 通过观察酵母细胞内报告基因的表达状况 研究DNA与蛋白质之间的相互作用 酵母单杂交步骤 设计含目的基因 诱饵 和下游报告基因的质粒 将其转入酵母细胞中 将文库蛋白的编码基因片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒转化入同一酵母细胞中 若文库蛋白与目的基因相互作用 可通过报告基因的表达将其筛选 单杂交优点 实验过程简单 耗时短 能直接识别并找出与特异顺式作用元件相结合的蛋白质及其编码序列 而不需通过制备纯化蛋白或抗体等繁琐的生化手段来建立这种相互作用关系 酵母属于真核生物 且蛋白质处于自然构象 避免了体外研究的不足 单杂交局限性 与内源性的表达激活因子发生相互作用 假阳性 插入的靶元件有可能不需要转录激活因子就可以直接激活报道基因的表达 假阴性 融合蛋白有毒性 不能稳定地表达 错误折叠不能准确定位于酵母细胞核内 DNA结合位点被封闭 酵母细胞内蛋白修饰缺乏 TF 介导蛋白质相互作用的第三种因子 可以是蛋白质 DNA RNA或小分子配体 两个蛋白之间通过第三者发生相互作用 用来检测蛋白质与RNA 蛋白 小分子配体间相互作用 酵母三杂交技术 应用 1 研究RNA 蛋白质间相互作用 应用 2 研究小分子受体与蛋白质受体间相互作用 在该系统中 第三个杂交小分子为Dex 地塞米松 FK506偶联体 利用已知的地赛米松受体和FK506受体FKBP12分别构建AD和BD融合蛋白 三种分子相互作用后 成功的激活了报道基因的表达 而当单体FK506分子引入时 由于竞争性结合FKBP12 导致三元复合物无法形成 几乎完全抑制了报道基因的表达 举例 3 研究复杂的蛋白 蛋白间相互作用 应用 不能用来研究位于细胞核外的RNA分子 许多蛋白质需要辅因子作用使其结合到它们的对应的RNA上 然而