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第二代高通量测序技术简介 四大高通量测序平台Solexa 454 GS FLX SOLiD和Polonator测序原理合成法测序 SequencingbySynthesis 连接法测序 SequencingbyLigation 454 GS FLX Roche 2005 2007 2008 原理 在DNA聚合酶 ATP硫酸化酶 荧光素酶和双磷酸酶的作用下 将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来 通过检测化学发光信号的有无和强度 达到实时检测DNA序列的目的 454 GS FLX 流程 1 文库制备 基因组DNA cDNA片段化处理至300 800bp间 经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA 454 GS FLX 流程 2 EmulsionPCR 单链DNA文库被固定在DNA捕获磁珠上 乳化 形成油包水的混合物 每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增 回收纯化 454 GS FLX 流程 3 测序反应 携带DNA片段的磁珠被放入PTP板中供测序反应使用 454 GS FLX 流程 4 数据分析 GSFLX系统在10小时的运行当中可获得100余万个读长 读取超过4 6亿个碱基信息 Solexa IlluminaGenomeAnalyzer 核心技术 DNA簇 和 可逆性末端终止 原理 将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面 即Flowcell 这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后 在Flowcell上形成了数以亿计Cluster 每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇 然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸 通过可逆性终止的SBS 边合成边测序 技术对待测的模板DNA进行测序 SOLiD ABI AppliedBiosystems SOLiD SequencingbyOligonucleotideLigationandDetection 原理 用连接法测序获得基于 双碱基编码原理 的SOLiD颜色编码序列 随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的reference序列 把SOLiD颜色序列定位到reference上 同时校正测序错误 并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在SNP位点 SOLiD流程 1 SOLiD基因组文库的构建 SOLiD流程 2 油包水PCR SOLiD流程 3 含DNA模板P1磁珠的固定 SOLiD流程 4 SOLiD双碱基编码原理及测序流程 SOLiD流程 4 SOLiD双碱基编码原理及测序流程 SOLiD流程 5 数据分析原理 Polonator 测序原理 Polonator系统高质量测序是一种以连接反应进行DNA序列分析的技术 该系统采用结合在磁珠上单分子DNA片段簇为测序模板 以CY5 TexasRed CY3 6 FAM四色荧光标记的9碱基单链荧光探针混合物进行连续的连接反应为基础 对
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