食品卫生微生物学检验技术ppt课件.ppt

食品卫生微生物学检验技术 引言 中国工程院院士陈君石在2019年12月6日召开的中国工程科技论坛十周年座谈会上作上述表示 人们对于食品安全问题尚缺乏科学 正确和客观的了解 所以我们需要传播一些基于科学的认识和一些应该采取的措施 比如消费者普遍关心的是食品当中存在的化学性污染 像农药残留 兽药残留 重金属以及环境污染物等 对 真正第一号的食品安全问题 由致病性微生物引起的食源性疾病反而比较忽视 陈院士说 这说明老百姓对食品安全缺乏科学 客观的认识 内容提要 一 食品微生物学检验基础知识 1微生物的概念微生物是指那些个体微小 结构简单 肉眼看不到必须借助显微镜才能观察得到的一群微小生物 2微生物的种类广义的微生物包括细菌 病毒 立克次体 放线菌 衣原体 真菌 霉菌 酵母菌 蓝藻 支原体等 3微生物的特点个体微小 结构简单 代谢能力强 繁殖速度快 种类繁多 分布广泛 容易发生变异 一 食品微生物学检验基础知识 4微生物与人类的关系自然界中的绝大多数微生物对人类都是无害的和有益的 微生物在食品工业中具有广泛的应用 例如酿酒 发酵 制作调味品 乳酸等 香菇 蘑菇 木耳等大型真菌的菌体也可以作为天然的食品 现代化学工业常常利用微生物生产有机酸 氨基酸等 微生物所产生的抗生素等生物活性物质应用于医药业 然而一部分微生物则是引起食品腐败变质 造成食品感官品质 食用价值损害的因素 同时也可能造成食物中毒等危害人类健康的食品安全事件 一 食品微生物学检验基础知识 5微生物的形态与结构微生物是一个很大的生物群体 通常按照细胞结构的差异划分为三类 即原核细胞型 真核细胞型 非细胞型 微生物 原核细胞生物 细菌 真核细胞生物 霉菌 酵母菌 非细胞型生物 病毒 一 食品微生物学检验基础知识 5 1细菌细菌属于单细胞的原核细胞型微生物 仅有原始的细胞核而无核膜与核仁 细胞器也不完整 细菌的外形通常有球状 杆状 螺旋状 包括弧菌 三大类 细菌的个体微小通常以微米来表示 必须借助光学显微镜才能观察到 细菌是食品中最常见的微生物 一 食品微生物学检验基础知识 细菌的基本结构有细胞壁 细胞膜 细胞质 核质 质粒等 某些细菌还具有一些特殊结构 例如鞭毛 荚膜 菌毛 芽孢等 一 食品微生物学检验基础知识 5 2真菌真菌属于真核细胞型微生物 真菌在进化水平上较细菌高 个体也比细菌大 真菌分为单细胞和多细胞两大类 常见的单细胞型真菌是酵母菌 多细胞型真菌能够形成菌丝和孢子 菌丝伸长分支 交叉纠缠成团状 称之为丝状菌或霉菌 还有一类大型真菌 可以形成体积巨大的子实体 可以供食用或药用 例如蘑菇 木耳等食用菌 一 食品微生物学检验基础知识 一 食品微生物学检验基础知识 5 3病毒病毒属于非细胞型的微生物 比细菌还要小得多 病毒没有完整的细胞结构 不能独立生活 只能寄生在活的细胞内 所有病毒的结构都是蛋白质外壳和核酸 病毒形态多样 常见的有棒状 弹状 球状 蝌蚪状等形态 其大小也从10nm到200nm不等 一 食品微生物学检验基础知识 6 1有害微生物对人类和生产的影响 引起食品变质引起食物中毒导致人体患病 一 食品微生物学检验基础知识 是衡量食品卫生质量的重要指标 也是判定被检食品能否食用的科学依据可以判断食品加工环境及食品卫生的情况 为卫生管理工作提供科学依据可以有效地防止或减少食物中毒和人畜共患病的发生保证产品的质量 避免不必要的损失 生产环境的检验 原辅料的检验 食品加工 储藏 销售储环节的检验 食品的检验 一 食品微生物学检验基础知识 一 食品微生物学检验基础知识 指示菌概念 在常规安全卫生监测中 用以指示检样卫生状况及安全性的指示性微生物类型 一般性 特定性 如粪便污染 其他项目 菌落总数 大肠菌群 耐热大肠菌群 总大肠菌群食源性致病菌及其毒素沙门氏菌 志贺氏菌 金黄色葡萄球菌及其肠毒素 溶血性链球菌 蜡样芽孢杆菌 副溶血性弧菌 单增李斯特菌 阪崎肠杆菌 空肠弯曲菌 致病性大肠埃希氏菌等霉菌酵母菌及其毒素黄曲霉毒素B1 B2等其他项目抗生素残留 beta 内酰胺酶 商业无菌等 一 食品微生物学检验基础知识 8常用设备光学显微镜培养箱水浴箱 一 食品微生物学检验基础知识 超净工作台 侧流式 直流式和外流式干燥箱高压蒸汽灭菌器 一 食品微生物学检验基础知识 离心机滤菌器均质器 匀浆器 冰箱 一 食品微生物学检验基础知识 玻璃器材及其他试管三角烧瓶烧杯玻璃棒培养皿接种环涂布棒酒精灯移液管移液器剪刀 镊子试管架 一 食品微生物学检验基础知识 10培养基10 1培养基中的主要成分及其作用营养物质 N源 C源 无机盐 生长因子 水水 用蒸馏水 不能用自来水凝固剂 琼脂 明胶 血清等抑制剂 鉴定细菌 抑制杂菌的生长繁殖 增加待检菌的检出率指示剂 用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物 产酸产碱的能力 一 食品微生物学检验基础知识 10 2培养基的类型在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质 都叫做培养基 Media 由于各类微生物对营养的要求不同 培养目的和检测需要不同 因而培养基的种类很多 我们可根据某种标准 将种类繁多的培养基划分为若干类型 一 食品微生物学检验基础知识 根据培养基的物理状态来区分固体培养基液体培养基半固体培养基根据培养基的用途来区分增殖培养基选择培养基鉴别培养基 一 食品微生物学检验基础知识 10 3培养基制备的基本方法和注意事项培养基的制备记录培养基成分的称取培养基各成份的混合和溶化培养基pH的初步调正培养基的过滤澄清培养基的分装培养基的灭菌培养基的质量测试培养基的保存 一 食品微生物学检验基础知识 10 4培养基的灭菌含糖类或明胶的培养基 113 灭菌15分钟或115 灭菌10分钟 无糖培养基 121 灭菌15 20分钟 血液 体液和抗生素等以无菌操作技术抽取后再加入冷却至约50 左右的培养基中 琼脂斜面培养基应在灭菌后冷至55 60 时取出 再摆置成适当斜面 一 食品微生物学检验基础知识 10 5培养基的保存基础培养基不能超过两周生化试验培养基不宜超过一周 选择性或鉴别性培养最好当天使用 倾注的平板培养基不宜超过3天 一 食品微生物学检验基础知识 培养基 玻璃器皿天平秤 药匙 培養基配製 儀器 杀菌锅 Autoclave 无菌操作台 Laminarflow 培养基的配制 装水 以量桶裝取適當量蒸馏水於玻璃容器中於玻璃容器上标示培养基名称 培養基配製 秤藥 放上秤藥紙並歸零以秤藥匙舀出適當量培養基 請看培養基罐上說明 培養基配製 溶解培養基 傾倒培養基時小心不要沾到玻璃壁上 注意事項 配藥結束 清理配藥桌面與天平清洗秤藥匙 擦乾放回藥品放回藥品櫃 培養基配製 分裝 調整分注器 Dispensette 刻度分裝試管蓋上試管蓋 放入杀菌锅 Autoclave 灭菌 培養基配製 灭菌 加水蓋過鐵板 放東西 關門 調整溫度時間 關緊洩壓閥 注意事項 杀菌锅的使用 注意事項 殺菌釜使用 滅菌結束後 等壓力降回零時才可打開門 進入殺菌釜之物品 蓋子不可關太緊或太鬆 培養基配製 平板培養基 滅過菌之固態培養基於無菌操作台 Laminarflow 內倒製平板培養基 Plate 一 食品微生物学检验基础知识 11微生物检验的基本操作技术无菌技术微生物的接种与分离技术微生物的培养方法微生物的生长现象与观察 一 食品微生物学检验基础知识 11 1什么是无菌技术 指在微生物实验工作中 控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施11 2无菌环境无菌室无菌柜超净工作台 一 食品微生物学检验基础知识 无菌室无菌室的结构 更衣间 缓冲间 操作间 无菌室的消毒和防污染每日 使用前 紫外线照射 1 2小时 每周用甲醛 乳酸 过氧乙酸熏蒸 2小时 每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒 一 食品微生物学检验基础知识 超净工作台超净台的使用与保养 1 风速保持在0 32 0 48米 秒 2 使用前开启紫外灯照射30分钟以上 3 让超净台预工作10 15分钟 4 使用完毕后 用70 酒精将台面和台内四周擦拭干净 一 食品微生物学检验基础知识 11 3无菌器材灭菌器材 玻璃器皿 培养基 无菌衣等 消毒器材 无菌室内的凳子 试管架 天平 工作台 手等 一 食品微生物学检验基础知识 11 4无菌操作目的 是保证待检物品不被环境中微生物的污染 是防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员 一 食品微生物学检验基础知识 11 5进入无菌室前的准备定期检查无菌环境的空气是否符合规定 用紫外线灭菌处理30 60分钟 检查无菌器材是否完备 洗手消毒 手部消毒后 再穿戴无菌工作服 一 食品微生物学检验基础知识 11 6检验操作过程的无菌操作要求在操作中不应有大幅度或快速的动作 使用玻璃器皿应轻取轻放 在火焰正上方操作 接种用具在使用前 后都必须灼烧灭菌 在接种培养物时 动作应轻 准 不能用嘴直接吸吹吸管 带有菌液的吸管 玻片等器材应及时置于盛有5 来苏尔溶液的消毒桶内消毒 无菌操作 取菌技巧1 无菌操作 取菌技巧1 5 試管前端過火 蓋上試管蓋 6 接種環燒紅滅菌 无菌操作 取菌技巧1 2 自Plate上取單一菌落 方法一 蓋子微開遮住培養基 避免空氣中菌體掉入 方法二 plate反面拿起 无菌操作 取菌技巧2 1 試管前端過火 2 打開試管蓋 无菌操作 接菌技巧 操作時離火源遙遠 試管直放 空氣中菌體容易掉入 無菌操作 錯誤示範 一 食品微生物学检验基础知识 11 7分离纯化倾注平板法涂布平板法平板划线法 一 食品微生物学检验基础知识 11 8微生物的培养方法一般培养法 需氧培养 厌氧培养法CO2培养法 一 食品微生物学检验基础知识 11 9微生物培养特性观察与记录在固体培养基上 观察 菌落大小 形态 颜色 光泽度 透明度 质地 隆起形状 边缘特征及迁移性等 在液体培养中 表面生长情况 菌膜 环 混浊度及沉淀等 半固体培养基穿刺接种 观察运动 扩散情况 一 食品微生物学检验基础知识 12消毒灭菌技术灭菌 杀灭物体表面或内部所有的微生物 包括病原微生物和非病原微生物 的繁殖体和芽孢的过程 消毒 用物理的 化学的或生物学的方法杀死病原微生物的过程 具有消毒作用的药物称为消毒剂防腐 防止或一致微生物生长繁殖的方法 用于防腐作用的药物称为防腐剂 无菌 不含有活的微生物的状态 一 食品微生物学检验基础知识 12 1物理灭菌法物理灭菌的方法有光 热和机械等 按照不同需求采用不同的方式 培养基和器械采用加热灭菌 但某些不耐热的液体培基则采用过滤除菌法 加热灭菌是最常用的灭菌方法 通过加热产生高温使得菌体蛋白质变性凝固 酶失活 从而达到灭菌目的 加热灭菌又可分为湿热和干热两种 同一温度下 湿热的灭菌效果比干热好 一 食品微生物学检验基础知识 干热灭菌法 通过使用干热空气杀灭微生物的方法称为干热灭菌法 通常把待灭菌的物品包装好放入干燥箱中烘烤 加热至160 170 维持2个小时 该法可用于玻璃器皿 金属器械的灭菌 凡是带有橡胶的物品 液体及固体培养基等均不可以用此法灭菌 一 食品微生物学检验基础知识 物品在灭菌前须正确包裹和加塞 以保证灭菌后的物品不在被污染 平皿应用纸包扎或放入金属平皿筒内 移液管的顶端应用少量脱脂棉塞住 并烧掉露在外面的多余棉絮 然后集中放入金属筒中或用纸条单独包裹后灭菌 包裹好的物品放入干燥箱中不应放得过于密集 以免妨碍空气流通 待灭菌的物品不得与干燥箱的内层地板直接接触 160 恒温干烤2个小时后即可完成灭菌过程 待温度降至50 60 时方可打开箱门防止玻璃器皿因骤冷而破裂 一 食品微生物学检验基础知识 湿热灭菌法 常用的有巴氏消毒法 煮沸消毒法 流通消毒法 高压蒸汽灭菌法 牛奶或酒类等不耐热的物质可以按巴氏消毒法 在较低的温度下消毒 医用器械如手术刀 剪刀 镊子等可以进行煮沸消毒 高压蒸汽灭菌法用途最广 效率较高 是微生物实验中最常见的灭菌方法 这种方法的原理是水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高 当蒸汽压力达到103 4kPa的时候 水蒸气的温度升高到121 经过15 20分钟 可以全部杀死灭菌物品中的各种微生物及其孢子和芽孢 此法适用于耐高温而又不怕蒸汽的物品 所用的设备称为高压蒸汽灭菌器 手提式高压蒸汽灭菌锅的使用方法关好排水阀门放入清水至标度为止 将要灭菌的物品用牛皮纸盖好后放入灭菌锅中 关上器盖 通电加温 同时打开排气阀门 排尽锅内的空气 再关闭阀门 当达到所需温度时开始计时 并在此温度下保持所需的时间 稍微打开一点排气阀门 使锅内蒸气缓慢排除 当压力表指针降到零 锅内蒸气完全排尽时 立即打开锅盖取出物品 最后将高压灭菌器内的剩余水排出 一 食品微生物学检验基础知识 过滤除菌法 凡不能耐受高温或化学药物灭菌的药液 毒素 血液等可用滤菌器机械除菌 4 紫外线灭菌法 波长为253 7nm的紫外线杀菌效果最佳 但是紫外线的穿透力不够强 只能用于空气或物体表面消毒 距离紫外灯1 5 2 0m以内的1平方米范围内经照射30分钟可以形成无菌区域 一 食品微生物学检验基础知识 12 2化学灭菌法一般化学药剂无法杀死所有的微生物 而只能杀死其中的病原微生物 所以是起消毒剂的作用 而不是灭菌剂 能迅速杀灭病原微生物的药物 称为消毒剂 能抑制或阻止微生物生长繁殖的药物 称为防腐剂 常用的化学消毒剂有 石碳酸 来苏水 甲醛溶液 氯化汞 碘酒 酒精等 内容提要 1964年卫生部印发了 食品卫生检验方法 细菌学部分 1976年 食品卫生检验方法微生物学部分 GB4789 84增加了总则 耶尔森氏菌 空弯 抗生素残留 共28项 大肠菌群由6管法改为9管法 方法内容简练 检验步骤条理化 简明易懂 GB4789 94 菌落总数的培养时间由24h改为48h 对耶尔森菌 空弯 副溶血性弧菌进行了补充和改进 增加了李斯特氏菌 椰毒假单胞菌 商业无菌 金葡肠毒素 沙门菌 志贺菌和致泻大肠的噬菌体检验 共31项 食品卫生微生物学检验方法国家标准的演变 微生物学检验方法国家标准的演变 现行有效的GB4789系列标准 内容提要 菌落总数的几个概念 菌落总数 AerobicPlateCount 食品检样经过处理 在一定条件下培养后 如培基 温度 时间 pH 需氧性质等 所得1mL g 检样中形成菌落的总数 只包括一群在平板技术琼脂上生长发育的嗜中温需氧或兼性厌氧菌的菌落总数 菌落总数不等于细菌总数 菌落 Colony 单个微生物在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度 形成肉眼可见有一定细菌群落 CFU ColonyFormingUnits 菌落形成单位 菌落总数的意义 反映食品被细菌污染的程度预测食品耐放程度和时间估测食品腐败状况实际上是把检样中得致病菌 非致病菌 酵母菌 霉菌都计算在内的微生物杂菌总数由于倾注平板法的局限 会有一部分细菌在该实验条件下不生长 故计数结果要比实际值低 菌落总数第一法操作流程图 友情提示 若样品中可能含有表面蔓延生长的菌落时 可在培基凝固后再覆盖一薄层培基水产品置于30 1 培养72h 3h 倾注平板计数法原理 菌落计数方法 有较大片状菌落生长者不宜采用 若片状小于平板一半时且余部均匀分布 则以半个平板菌落数2倍报告无明显界限链状菌落每条单链视为一个菌落 选取菌落数在30 300cfu之间 无蔓延生长的平板计数低于30的记录具体菌落数 大于300的可记录为多不可计 每个稀释度采用两个平行的均数 计数结果的表述 若只有一个稀释度平板在30 300CFU 则计算两平行平板的均数 再乘以稀释倍数报告之若有连续两个稀释度符合计数要求则按下公式 例1 10 2 232 24410 3 33 35例2 10 1 232 24410 2 33 29 菌落总数 所有符合计数要求的平板菌落数之和 较低稀释度有效平板数 较高稀释度有效平板数 较低稀释度的稀释倍数 N 232 244 33 35 2 2 0 1 10 2 新计数公式的统计学依据 平板菌落数越多 结果越具有代表性 不考虑稀释倍数和培养基的营养状况等 取样量越大 结果越具有代表性 同等取样条件 排除其他方面的干扰因素 不同的取样量赋予不同的权重 而不是简单的取平均值 新旧方法计算同一结果会有所不同 结果表述 Illusion Howtocalculate 30cfu 300cfu 报告方式 菌落数在100cfu内时按四舍五入修约 采用两位有效数字报告大于或等于100时 第三位数四舍五入修约 取前两位数字 例 205043 21000or2 1 105所有平板均为蔓延菌落而无法计数者报告菌落蔓延若空白对照有菌落则此次检测结果无效固体样品以cfu g 液体以cfu mL为单位 GB4789 15 2019霉菌酵母菌计数 基本过程类似菌落总数所用培养基为孟加拉红 马铃薯 葡萄糖琼脂培养基 PDA 稀释液为无菌水 可以用生理盐水吗 培养温度为25 28度 时间为5天计数方法 选择10 150cfu的平板报告之 余规则同GB4789 2 2019菌落总数 详见GB4789 15 2019的规定 霉菌和酵母菌的食品卫生学意义 霉菌酵母菌可使食品和粮食发生霉变 常在低pH 低湿度 高盐 高糖含量食品中出现低温贮存的或含抗生素的食品亦可出现霉菌酵母菌能合成有毒代谢物引起各种急慢性中毒 特别某些霉菌毒素强烈致癌作为评价食品卫生质量的指示菌 判定食品被其污染程度 便于对检样进行卫生学评价 典型霉菌酵母菌菌落形态观赏 酵母菌菌落多类似细菌菌落 但大而厚 湿润 粘稠 易挑起 某些菌种长时间培养而呈皱缩状 颜色多为乳白 少数红色 霉菌菌丝粗长 其菌落疏松 呈绒毛状 棉絮状或蛛网状 有的菌落呈圆形 有的无定形 由于其形成的孢子不同故其菌落常呈现肉眼可见的不同结构和色泽特征 商业无菌 概念 罐头食品经过适度的杀菌后 不含有致病性微生物 也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物 这种状态叫做商业无菌 保温 低酸性罐头食品 36 10天酸性罐头食品 30 1 10天预定输往热带地区的低酸性食品 55 1 5 7天每日检查是否胖听 泄露 开罐 留样 pH测定 感官检查 涂片染色 接种 内容提要 GB4789 3 2019大肠菌群测定 定义 Coliforms 一群在36 培养48h可发酵乳糖 产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏染色阴性无芽孢杆菌 该菌主要来源自人畜粪便 作为粪便污染指标评价食品的卫生状况 推断食品中肠道致病菌污染的可能 大肠菌群的食品卫生学意义 作为粪便污染食品的指标菌 MPN值愈低则说明食品受粪便污染程度及对人体健康危害程度愈低作为肠道致病菌污染食品的指针 大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在的可能性就越高 但两者之间并不总是呈平行关系要求食品中大肠菌群完全不存在是不可能的 重要的是其污染程度即菌量 产气克雷白氏菌 大肠杆菌是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌 是粪便中的主要菌种 一般生活在人大肠中并不致病 但它侵入人体一些部位时 可引起感染 大肠菌群并非细菌学分类命名 而是卫生细菌领域的用语 它不代表某一个或某一属细菌 而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌 这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致 一般认为可包括大肠埃希氏菌 柠檬酸杆菌 产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等 总大肠菌群系指一群在37 培养24小时能发酵乳酸 产酸产气 需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌 耐热大肠菌群即粪大肠菌群 作为一种卫生指标菌 耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物 因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染 可能存在大肠杆菌 但是 耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害 致病性大肠杆菌能引起食物中毒 致病性菌株能侵入肠粘膜上皮细胞 具有痢疾杆菌样致病力 肠致病性大肠杆菌 EPEC 肠毒素性大肠杆菌 ETEC 和肠侵袭性大肠杆菌 EIEC 等 O157 H7 EHEC 肠出血性大肠杆菌 感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病 已逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫生问题 大肠菌群 粪大肠菌群 大肠杆菌的从属关系 第一法MPN法 初发酵 月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤 LST 替代了乳糖胆盐发酵培基确证实验 煌绿乳糖胆盐肉汤 BGLB 替代了乳糖复发酵培养基 取消了革兰氏染色实验培养时间 由24h延长至48h单位 由MPN 100g变为MPN g取样量 由3 33g 0 333g 大肠菌群计数检验流程 0 将产气的试管内样品接种到BGLB肉汤 LST不产气 小导管里无气泡 LST产气 如何报告结果 根据经确证后的对应浓度阳性管数查MPN表MPN 最可能数 基于泊松分布的一种间接计数方法 理想与现实的差距 新的方法更加严谨 合理 科学 与世界接轨然而老的卫生标准仍然沿用MPN 100g mL 0 3MPN g 30MPN 100g 如何换算 30MPN 100g 0 3MPN g 加样量相应扩大10倍 1g 0 1g 0 01g 符合原方法的取样量 查表 结果相应缩小10倍统计学上并不一定成立 只是过度临时采用仍然报告为0 3MPN g 但要通知相关人员原因 卫生部关于菌落总数报告方式的16号公告 第二法VRBA平板计数法 选择菌落数为15 150个的平板计数典型和可疑菌落 36 1 18h 24h 挑选10个菌落接种到BGLB 37 24 48h 典型菌落为紫红色周围有红色胆盐沉淀环 0 5mm 如何写出厂检验记录和报告 内容提要 致病菌的食品卫生学意义 食品卫生标准规定任何食品中不得检出致病菌致病菌对人体健康的威胁是直接的和肯定的根据不同食品被污染的特点重点检验某些细菌如蛋禽肉主检沙门氏菌 罐头检肉毒梭菌等微生物毒素也是重点 如金葡的肠毒素 黄曲霉毒素等 微生物与食物中毒 概念 指摄入了含有生物性 化学性有害物质的食品或把有毒有害物质当作食品摄入后出现得非传染性的急性 亚急性疾病 特点 潜伏期短 来势急剧 短时多人同时发病 临床表现大致相同 与吃某种有毒食品有关 发病率高 人与人之间并不传染 分类 微生物性 细菌性 真菌性 化学性 动 植物性 以细菌性最常见 细菌性食物中毒 概念 由于食入被病原菌或其毒素污染的食物后所引起的以急性肠胃炎为主的疾病 分类 感染型 毒素型 不定型 GB4789 4 2019沙门氏菌检测方法 本标准参考采用了AOAC FDA的方法 本标准与GB T4789 4 2019相比主要修改如下 规范了样品制备过程 修改了原标准中前增菌和增菌部分 修改了原标准中分离部分 增加了科玛嘉显色琼脂 对原标准中生化试验部分进行了修改 增加了API20E生化鉴定试剂盒或VITEKGNI 生化鉴定卡 于2019年11月1日开始正式实施 沙门氏菌食物中毒 引起食物中毒最常见的沙门氏菌 鼠伤寒沙门氏菌 肠炎沙门氏菌 猪霍乱沙门氏菌易引起沙门氏菌中毒的食品 肉 蛋 乳类食品中毒原因 1 食用病畜禽的肉制品食品2 病畜禽 带菌人和动物使食品受污染3 用不洁净水外理食品 美国两种花生酱含沙门氏菌 沙门氏菌的从属与分类 归于肠杆菌科沙门氏菌属下设6个亚属 I II IV V VI及III 原亚利桑那菌属 常见的种 鸡沙门氏菌 鼠伤寒沙门氏菌 伤寒沙门氏菌 形态与染色 革兰氏染色阴性 无荚膜 无芽胞 多数有鞭毛 有动力 短小杆菌 培养特性 需氧或兼性厌氧 最适温度37 PH7 2 7 4 营养要求 不高 普通培养基生长良好 4 2GB T4789 4 2019沙门氏菌检验流程 沙门氏菌菌落形态 BS XLD DHL 海博第二代显色培基 HE SS XLT4 前增菌 BPW 碱性蛋白胨水 用于修复受损伤的沙门氏菌 但由于其不具有选择性 因此增菌时间过长会导致杂菌生长过多干扰鉴定结果 故建议最好控制在4h为好 经前增菌后的样品与选择性培养基按1 10加入 例如1mL样品加入10mLSC中未经前增菌而直接进行选择性增菌的样品最好与增菌液按1 1稀释 而不可按1 10稀释 因为食品中沙门氏菌数量较少 1 10稀释将降低检出率 常用选择性培养基比较 主要杂菌为大肠埃希氏菌 而两者区别在于是否发酵乳糖 故加入乳糖 酸碱指示剂两个指针来判断可疑菌落加入硫化氢是因为第III属产硫化氢而缓慢发酵乳糖BS选择性最强 可延长时间以免沙门菌生长亦被抑制多采用BS搭配DHL SS HE WS 互补防漏检 克氏三糖铁 TSI 反应原理 三糖铁 TSI 反应模式及意义 若分解硫化氢则产生黑色FeS沉淀 若分解糖类产气则可见气泡或裂缝只有斜面和底层均产酸 且赖氨酸脱羧酶阴性者才可排除为沙门菌的可能性其余情况既可能是也可能不是沙门氏菌属的细菌 生化实验原理 硫化氢实验 目的 检测细菌对含硫化合物的分解能力原理 细菌分解含硫氨基酸生成硫化氢与培养基中的铁或者铅离子生成黑色化合物 方法 接种三糖铁琼脂或悬挂醋酸铅试纸 结果 培养基出现黑色为阳性 生化实验原理 动力试验 原理 在半固体上穿刺接种后 细菌因具有鞭毛扩散生长结果 阳性 扩散生长阴性 沿穿刺线生长 注意 培养基温度 剧烈运动可能出现假阳性结果 生化实验原理 糖苷醇类发酵试验 不同细菌含发酵各种糖类的酶不同 分解糖类 糖醇类 的能力亦不同 根据分解不同糖类后产物的差异 来鉴定细菌 结果 若细菌分解糖类产酸 使培养基中的指示剂显酸性反应 颜色发生变化 若产气可使培养基中的导管或者琼脂出现气泡 无变化则说明阴性 说明 指示剂 酚红 黄红 溴甲酚紫 黄紫 溴麝香草酚蓝 黄蓝 注部分糖类灭菌需防止高温破坏 目的 通过不同细菌对氨基酸之羧基的分解能力来鉴别细菌 原理 细菌产生的脱羧酶可脱掉氨基酸之羧基 生成胺和CO2 使培养基PH升高 指示剂显色 常用氨基酸有三种 赖氨酸 经赖氨酸脱羧酶生成尸胺和CO2 鸟氨酸 经鸟氨酸脱羧酶生成腐胺和CO2 精氨酸 经精氨酸脱羧酶生成精胺和CO2 结果 检测培养基由黄色变紫色为阳性 黄色为阴性 对照 无氨基酸 为黄色 生化实验原理 赖氨酸脱羧酶试验 生化实验原理 尿素酶试验 目的 通过检测尿素酶来进行肠杆菌科细菌的鉴定原理 细菌产生的尿素酶分解尿素产生大量的氨 使培养基PH值升高 用酚红指示剂测出 结果 培养基变红为阳性 不变为阴性 生化实验原理 氧化酶实验 原理 细胞色素C 对苯二胺 萘酚 吲哚酚蓝 试纸片法操作 1 白金环取菌苔到试纸上2 加 滴生理盐水到试纸 结果 阳性 0秒内变蓝 阴性 不变色注意 避免含铁物质 空气易氧化 生化实验原理 靛基质实验 靛基质试验 目的 用于肠杆菌科细菌的鉴定 原理 细菌分解蛋白胨中色氨酸生成的吲哚与试剂中的二甲氨基苯甲醛作用生成红色的玫瑰吲哚 方法 纯培养物接种蛋白胨水后35 培养24 48h沿管壁徐徐加入Kovac氏试剂或欧氏试剂0 5ml观察 结果 两层液体交界处出现红色为阳性 无色为阴性 生化实验原理 氰化钾实验 原理 氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂 可与呼吸酶作用使酶失去活性 抑制细菌的生长 但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长 以此鉴别细菌 试验方法 取培养20 24h的营养肉汤培养液或菌落1环 接种至对照培养基及氰化钾培养基内 立即以橡胶塞塞紧 36 1 培养24 48h 观察结果 结果记录 对照管有菌生长 试验管有菌生长为阳性 对照管有菌生长 试验管无菌生长为阴性 生化实验原理 半乳糖苷酶试验 ONPG实验 目的 迅速及迟缓分解乳糖的细菌阳性 而不发酵乳糖的沙门氏菌为阴性 原理 细菌迅速分解乳糖是有 半乳糖苷渗透酶和 半乳糖苷酶 但ONPG分子与乳糖相似且分子较小 故不需 半乳糖苷渗透酶也可分解乳糖 结果 呈现黄色为阳性反应 通常20 30min内显色注意 为提高阳性反应速度 需大量接种培养物 过酸出现假阴性 过碱则出现假阳性 商品化的成套生化试剂盒 API生化鉴定系统是法国梅里埃生物公司出品的微生物生化检测系列产品 原理是利用细菌对于各类化学物质 碳水化合物 氨基酸及蛋白质 无机盐类等 的代谢能力以及酶类的存在与否等生化特性来鉴定细菌的一种方法 当反应能够导致反应体系的PH值变化或产生显色物质 加入合适的酸碱指示剂或显色剂就可以反映出来 API试验的本质就是利用生化试验的方法 检测细菌对各种物质的代谢作用及其代谢产物 常用于细菌的鉴别 1 分离单个菌落 2 调制菌液 3 将菌液接种到小杯中 4 试条放进孵育箱内 35 37度 18 24h 5 附加试剂加进适当小孔内 7 将反应结果输入数据库软件中得到生化谱代码 8 软件自动查询报告最符合的菌名 6 根据标准色卡判读反应结果 梅里埃Vitek 2和其它国产成套试剂 血清学实验原理 什么是血清学反应 血清学反应是指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用 可出现肉眼可见的沉淀 凝集现象 在微生物检验中 常用血清学反应来鉴定分离到的细菌 以最终确认检测结果 什么是抗原 是指能刺激机体免疫系统产生免疫应答而生成抗体和致敏淋巴细胞等免疫应答产物 并能与之发生特异性结合的物质 产生的相应抗体与抗原结合 形成抗原 抗体复合物 产生免疫反应 从而保护机体不受抗原侵害而造成破坏 一般抗原都是外来物体 如细菌 病毒 寄生虫等 血清学实验原理 什么是抗体 机体受外来抗原物质刺激后 产生的一种与该抗原发生特异性结合的免疫球蛋白 Ig 被分为G A M E D等 几类 最典型的抗体是IgG 有Y型三维结构 包含两套重链和轻链 抗体攻击抗原 居中者 血清学实验原理 何谓凝集反应 颗粒性抗原 细菌 红细胞等 与相应抗体结合 在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象 称为凝集反应 Agglutinationreaction 其中的抗原称为凝集原 抗体称为凝集素 何谓直接凝集反应 颗粒性抗原如细菌和细胞与相应抗体直接结合所出现的反应 玻片凝集法原理 何谓玻片凝集法 是一种常规的定性试验方法 用已知抗体来检测未知抗原 常用于鉴定菌种 血型 如将含有白叶枯病菌抗体的血清与待检菌液各一滴 在玻片上混匀 数分种后若出现肉眼可见的凝集块 即为阳性反应 证明该菌是痢疾杆菌 此法快速 简便 但不能进行定量测定 玻片凝集法原理 单价血清 含单一抗体的血清多价血清 含多种抗体的血清如A F多价步骤 先多价后单价 先常见的后不常见的 先O后H 根据结果查表得到鉴定菌种抗原准备 多采用15g L琼脂斜面培养物若O血清不凝集可转种至高含量 2 5 3 琼脂培基上 干燥利于O Ag发育 沙门氏菌的抗原类型 O抗原 菌体 O1 O67共58种 一种菌可能含1种或多种O Ag 含相同O Ag的归为一个血清群 有A B Z O57 63 O65 67 多为A F群 故先要用此多价血清初筛H抗原 鞭毛 特异相 a z z1 z55 非特异性相 1 2 l w 多为双相菌 可发生相位变异Vi抗原 表面 可阻止O与抗体反应 加热可消除 H抗原 菌体抗原 O抗原 表面抗原 Vi抗原 玻片凝集法操作 先应在玻片上滴加1滴生理盐水 加入菌苔做阴性对照并观察是否自凝 若有则说明该菌株发生S R变异失去了O抗原成为粗糙型 故不能进行血清学分型 菌体抗原 O抗原 的检测 A F多价血清不凝集 A F群常见菌型鞭毛抗原 H抗原 表 血清学实验原理 不常见的菌型 先用163种沙门菌血清中的8种多价血清排查 若其中任一种或两种凝集则再用其所包含的各种H因子逐一检查H多价1 a b c d IH多价2 eh enx enz15 fg gms gpu gq mt gz51 H多价3 k r y z z10 lv lv lz13 lz28 lz40H多价4 1 2 1 5 1 6 1 7 z6H多价5 z4z23 z4z24 z4z32 z29 z35 z36 z38H多价6 z39 z41 z42 z44H多价7 z52 z53 z54 z55H多价8 z56 z57 z60 z61 z62 志贺氏菌简介 志贺氏菌属为埃希氏杆菌 包括痢疾志贺氏菌 福氏志贺氏菌 鲍氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌四群 是引起人类细菌性痢疾的病原菌 它们主要通过食品加工 集体食堂和饮食行业的从业人员中痢疾患者或带菌者污染食物 从而导致痢疾的发生 是一种较常见的 危害较大的致病菌 志贺氏菌的鉴定主要根据血清学反应 再以生化反应证实 志贺氏菌检验流程 志贺氏菌属生化特性试验挑取平板上的可疑菌落 接种三糖铁琼脂和半固体琼脂各一管 志贺氏菌在三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸而不产气 福氏志贺氏菌6型可微产气 斜面产碱 不产生硫化氢 无动力 在半固体管内沿穿剌线生长 然后再做V P 苯丙氨酸脱氨酶 赖氨酸脱羧酶 西蒙氏柠檬酸盐和葡萄糖铵试验 结果均应阴性反应 葡萄糖半固体 无动力 志贺氏菌菌落形态 志贺氏菌在SS和Mac上形成较小的 无色半透明不发酵乳糖的菌落在HE上形成不发酵乳糖的深绿色菌落 HE上不发酵乳糖的肠道菌 可能就是志贺氏菌 SS上无黑色中心很可能是志贺氏菌了 Mac Mac GB4789 10 2019金黄色葡萄球菌检验 计数标准第一法 BairdParker增加了计算公式第二法 MPN法 新增加 致病性 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在 因而食品受其污染的机会很多 金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题 我国每年发生的此类中毒事件也非常多 中毒食品种类多 如奶 肉 蛋 鱼及其制品 此外 剩饭 油煎蛋 糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道 可通过以下途径污染食品 食品加工人员 炊事员或销售人员 食品在加工前本身带菌 或在加工过程中受到了污染 产生了肠毒素 引起食物中毒 熟食制品包装不严 运输过程受到污染 奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时 对肉体其他部位的污染 检测流程 计数及血浆凝固酶实验 接种BHI肉汤及营养琼脂斜面 金黄色葡萄球菌菌落形态 金葡在Baird Parker平板上菌落直径2 3mm 灰色到黑色 边缘淡色 周围有一浑浊带 外层有一透明圈 接种针接触有奶油至树脂硬度 偶见非脂肪溶解的类似菌落耽误浑浊带和透明圈 触媒实验 电镜下的金葡 海博显色培基 血浆凝固酶实验 目的 常用于鉴别葡萄球菌 原理 金黄色葡萄球菌可产生凝固酶 使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白附着于细菌表面产生凝固 分为与细胞壁结合的凝固酶 玻片法 与菌体生成后释放在培养基中的游离凝固酶 试管法 试管法 三只含1 4血浆0 5ml的试管各接种待检菌 阳性菌株和肉汤阴性菌株 待检菌出现凝固且阴性对照不凝固为阳性 细菌的溶血现象 根据细菌对红细胞的溶解能力可分为以下三种溶血类型及现象 甲型 溶血 产生溶血素 不完全性溶血 在血琼脂平皿上菌落周围有1 2mm 较窄半透明的草绿色溶血环 乙型 溶血 呈完全性溶血 在血平皿上菌落周围有2 4mm宽 界限分明 无色透明的溶血环 丙型 溶血 不产生溶血素 在血琼脂平皿上的菌落周围无溶血环 内容提要 溶血性链球菌 形态与染色 球形或椭圆形链状排列 无芽胞无鞭毛 革兰阳性培养特征 营养要求较高 普通培基生长不良 在血平板上形成灰白色 半透明 表面光滑 边缘整齐 细小菌落 致病性 可引起皮肤 皮下组织的化脓性炎症 呼吸道感染 流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症 细菌性心内膜炎等污染食品途径 食品加工或销售人员口腔 鼻腔 手 面部有化脓性炎症时造成食品的污染 食品在加工前就已带菌 奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局部化脓时熟食制品因包装不善而使食品受到污染 检验