夜香树花提取物体外抗肿瘤作用的实验研究

1 / 6夜香树花提取物体外抗肿瘤作用的实验研究作者：卢红梅，钟振国，赵世元，吕金燕【摘要】 目的探讨夜香树花提取物对体外培养的肿瘤细胞株生长抑制的影响。方法按极性递增原则回流提取得到夜香树花提取物总浸膏和正丁醇部位，再采用 MTT 法和集落形成法观察夜香树花提取物总浸膏和正丁醇部位对人胃癌细胞株 SGC7901、人肝癌细胞株 Bele7404、宫颈癌细胞株 Hela 的生长抑制情况。结果当夜香树花总浸膏浓度为 40g/ml 及正丁醇部位提取物浓度为 20 g/ml 时对 3种肿瘤细胞株的生长抑制率为%。结论 夜香树花提取物在体外具有明显抗肿瘤作用。 【关键词】 夜香树花; 总浸膏; 正丁醇部位; MTT法; 集落形成法夜香树(Cestrum nocturnum Linn，CN)，为茄科夜香树属植物，其花色黄绿或洁白，白昼闭合无香气，夜晚开放且香气浓郁，香味可驱蚊。对 CN 叶进行体外抗肿瘤实验研究结果表明，CN 叶提取物具有抗肿瘤作用，并且证明了有效成分主要集中在正丁醇部位1。为了探讨其花是否也具有抗癌作用，本实验对 CN 花提取物进行体外抗肿瘤研究。现将研究结果报道如下。2 / 61 材料与仪器药物 CN 花采自广西境内，经本学院药用植物教研室刘寿养教授鉴定为茄科属植物夜香树(Cestrum nocturnum Linn.);长春新碱(陕西博森生物制药，批号：XX0917)。肿瘤细胞株 人胃癌细胞株 SGC7901 和宫颈癌细胞株 Hela 购自上海细胞生物研究所细胞库，人肝癌细胞株Hele7404 由广西医科大学药理教研室提供。试剂 MTT(四甲基噻唑蓝)德国 Sigma 公司产品，批号：050609;FBS(胚胎牛血清)杭州四季青生物工程材料有限公司产品，批号：060226;RPMI1640 培养基，美国 GIBCO公司产品，批号：1120708;Trypsin(胰蛋白酶)天津市景洋生物制品有限责任公司产品，批号：00503;DMSO(二甲基亚砜)上海润捷化学试剂有限公司产品，批号：XX1026。仪器 CO2 培养箱(ThermO Forma)美国产;倒置显微镜(Olympus)，日本产;酶标仪(Biocell)，奥地利产;培养瓶(美国 Promega Corporation 产);96 孔板(德国产，型号：3679);培养皿(美国产，型号：3001);微量加样器(日本产，型号：Nichipet)。2 方法提取物的制备2CN 花晒干后，用乙醇提取浓缩得总浸膏后再用正丁醇回流提取，得到正丁醇部位。3 / 6MTT 法测定3，4取对数生长期的肿瘤细胞，用含10%小牛血清的 RPMI-1640 培养液调配成浓度为 5 000 个/ml，接种于 96 孔板，每孔加入 200 l，其中包括 190 l 肿瘤细胞悬浮液和 10 l 药液，试药按浓度递增原则各设 5 个不同的浓度，终浓度分别为 5，10，20，40，80 g/ml，每种药的每种浓度均设 3 个平行孔，空白阴性对照组为等容积的 RPMI-1640 培养基。在 37、10%CO2 条件下培养 3 d。弃去上清液后，每孔加入 200 l 浓度为 mg/ml 的 MTT 溶液(用 1640 培养基配制)，振荡混匀后继续培养 4 h。再弃去上清液，每孔加入 200 l DMSO 溶液，轻轻振荡使 MTT 甲臜沉淀溶解，用酶标仪(波长为 550 nm，参比波长为 450 nm)测定其 OD 值，计算抑制率，求 IC50。按下列公式计算药物对肿瘤细胞增殖的抑制率。抑瘤率(%)=(1-实验组平均 OD 值/对照组平均 OD 值)100集落形成法3，5取对数生长期的肿瘤细胞，用 ml、%的胰蛋白酶消化，细胞计数后用含 10%小牛血清的RPMI-1640 培养液调配成浓度 200 个/ ml，接种于 24 孔板，每孔加入 1 ml，其中包括 950l 肿瘤细胞悬浮液和 50 l 药液，药物的最终浓度为 10 g/ml，每种药每种浓度设 4 个平行孔，阴性对照组加入 950 l 肿瘤细胞悬浮液和 50 l RPMI-1640 培养基，摇匀后置 37、10%CO2 培4 / 6养 7d。弃去上清液，用瑞氏染液染色 5 min，然后用Giemsas 溶液与 Sorensen 磷钼酸缓冲液以 19 混合，染色 10 min。流水冲洗、凉干，在 20的显微镜下计数含 50个细胞以上的集落，重复 3 次。按下式计算集落形成率及抑制率。 集落形成率(%)=克隆数/接种细胞数100%集落抑制率(%)=1-克隆数/对照组克隆数100%统计学处理 以 SPSS 统计软件分析,两组间的均数比较采用 t 检验。3 结果MTT 法 CN 花不同提取物对 SGC7901、Bele7404 和Hela 细胞株增殖的影响。结果见表 1。表 1 CN 花不同提取物对肿瘤细胞增殖的抑制作用与空白对照组比较，*P 表 1 结果显示，总浸膏和正丁醇浸膏对 3 种肿瘤细胞株增殖均有抑制作用，抑制率与空白对照组比较有显著性差异，且抑制率与浓度成正比，其中正丁醇浸膏的抑制作用更为明显。总浸膏对 SGC7901、Bele7404 和 Hela 的 IC50 分别为， ， ，而正丁醇浸膏的分别为， ， g/ml。集落形成法 CN 花不同提取物对SGC7901、Bele7404 和 Hela 细胞株集落形成的影响。结果见表 2。5 / 6表 2 结果显示，在浓度为 10 g/ml 下，总浸膏和正丁醇浸膏对 3 种肿瘤细胞株的集落形成均有不同程度的抑制作同，与空白对照组比较(P 4 讨论体外筛选抗肿瘤药物具有用药少、周期短、费用少等优势，且其筛选结果与体内实验的相关性好，因此已被一些研究机构作为常规的抗肿瘤药物初筛手段6。MTT 法有灵敏度高、稳定性好、快速、操作简便、可评价率高、测定结果客观等优点7，近年来 MTT 法已取得丰硕成果，其方法学日臻完善，更接近临床，更具有实用价值，广泛用于化疗药物筛选和生物学及医学研究中8。而集落形成法能反映单个细胞的增殖能力，通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析，能较灵敏地测定抗癌药的活性，目前被认为是一种较理想的检测方法3。表 2 CN 花不同提取物对肿瘤细胞集落形成的影响与空白对照组比较，*P 实验首先对 CN 花提取物总浸膏和正丁醇浸膏进行 MTT 法实验，结果表明总浸膏和正丁醇浸膏对人胃癌细胞 SGC7901、人肝癌细胞 Bele7404 和人宫颈癌细胞 Hela 的增殖均有抑制作用，且抑制作用呈明显的剂量关系，尤其正丁醇浸膏的作用明显。在浓度为 80 g/ml 时，正丁醇浸膏的抑制率约在 80%，并且对 3 种细胞的 IC50 均小于 20 g/ml，而总浸膏的 IC50 接近 20 g/ml，原因可能是总浸膏所含杂质多，也说明了 CN 花提取物的主要有效成分主要集中在正丁6 / 6醇部位。按体外抗肿瘤疗效评价规定9：植物粗提物的IC50 小于 20 g/ml 时，则可断定药物在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。通过集落形成法对实验进一步验证，结果也表明其总浸膏和正丁醇浸膏能抑制细胞集落的形成。CN 花提取物在体外实验具有一定的抗肿瘤作用，但其抗瘤作用的真正机理、取物中究竟是何种成分在发挥作