生物化学实验指导手册

1 实验一 考马斯亮蓝实验一 考马斯亮蓝 G 250 法测定可溶性蛋白质含量法测定可溶性蛋白质含量 实验目的实验目的 学习 掌握考马斯亮蓝 G 250 法测定蛋白质含量的原理和方法 实验原理实验原理 考马斯亮蓝 G 250 在游离状态下呈红色 与蛋白质结合则呈现蓝色 染料的最大吸收从 465nm 变 为 595nm 蛋白质 染料复合物在 595nm 具有很大的光吸收值 蛋白质测定的灵敏度较高 最低检出 量为 1ug 蛋白质 本方法操作简便快捷 灵敏度高 测定范围 1 1000ug 实验材料 仪器及试剂实验材料 仪器及试剂 1 材料 新鲜的植物材料 2 仪器 722 分光光度计 天平 离心机 研钵 容量瓶 试管 移液管 漏斗 1 标准牛血清蛋白质溶液 0 1mg ml 2 考马斯亮蓝 G 250 溶液 实验步骤实验步骤 1 样品的提取 准确称取鲜样 2 克 用 2ml 蒸馏水在冰浴中研成匀浆 转移到 25ml 容量瓶中并定 容 在 8000rpm 冷冻离心 10min 取上清液待测 2 标准曲线的绘制 取 8 支具塞试管 按表 1 加入试剂 表表 1 1 不同蛋白质含量的牛血清蛋白质液配制表不同蛋白质含量的牛血清蛋白质液配制表 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 标准蛋白质溶液 ml 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 0 0 0 样品提取液 ml 0 0 0 0 0 0 0 2 0 2 蒸馏水量 ml 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 8 0 8 G 250 试剂 ml 5 5 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量 ug 0 20 40 60 80 100 x x 595nm 吸光值 将上面 8 支试管摇匀 放置 5 分钟后 用 1cm 光径比色杯在 595nm 下比色 记录吸光值 以蛋 白质浓度为横坐标 以吸光值为纵坐标绘制标准曲线 根据样品吸光值在标准曲线查得蛋白质含量 结果计算 结果计算 C VT 样品中蛋白质含量 ug g FW VS WF 1000 式中 C为查标准曲线值 ug VT 为提取液总体积 ml VS 为测定时加样量 ml WF为样品鲜重 g 2 实验二实验二 植物组织中游离氨基酸总量的测定植物组织中游离氨基酸总量的测定 实验目的实验目的 学习掌握鲜材料中游离氨基酸含量测定的原理和方法 实验原理实验原理 当氨基酸与水合茚三酮共热时 能定量地生成酮茚胺 该产物显示蓝紫色 称为 Ruhemans 紫 其 最大吸收值在 570nm 并在一定范围内与氨基酸含量成正比 氨基酸与茚三酮的反应分为两步进行 第一步 氨基酸被氧化形成 CO2 NH3和醛 茚三酮被还原成还原型茚三酮 第二步 所形成的还原型茚 三酮与另一个茚三酮分子和氨缩合生成 Ruhemans 紫 实验材料 仪器及试剂实验材料 仪器及试剂 1 材料 新鲜的植物材料 2 仪器 722 分光光度计 天平 离心机 水浴锅 研钵 容量瓶 试管 移液管 三角瓶 漏斗 3 试剂 1 水合茚三酮试剂 2 乙酸 乙酸钠缓冲液 pH5 4 3 标准亮氨酸标准液 含氮为 5ug ml 4 0 3 抗坏血酸溶液 实验步骤实验步骤 1 样品提取 取新鲜植物样品 0 5 1g 加 5ml 10 醋酸研磨 离心取上清液 0 5ml 用 pH5 4 醋酸盐 缓冲液 定容至 25ml 2 标准曲线的绘制 取 6 支 20ml 刻度试管 按下表进行操作 表表 1 1 制作游离氨基酸标准曲线各试剂量及操作程序制作游离氨基酸标准曲线各试剂量及操作程序 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 标准亮氨酸 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 0 0 0 样品提取液 ml 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 PH5 4 缓冲液 2 1 8 1 6 1 4 1 2 1 0 1 0 1 0 水合茚三酮 3 3 3 3 3 3 3 3 抗坏血酸 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 含氮量 g 0 1 2 3 4 5 x x 570nm 吸光值 加完试剂后混匀 在沸水中煮 5 分钟 然后在冷水中冷却 摇匀 稀释到 20 毫升 用 1cm 光径比色杯在 570nm 下测定吸光度 绘制标准曲线 根据样品吸光值在标准曲线查得氨基态氮含量 结果计算结果计算 C VT 100 克样品中氨基态氮含量 100 VS WF 3 式中 C 为从标准曲线上查得的氨基态氮含量 ug VT为提取液总体积 ml VS 为测定时加样量 ml WF为样品鲜重 g 实验三实验三 酶的特异性 温度 酶的特异性 温度 pH 对酶活性的影响对酶活性的影响 一 酶的特异性 一 酶的特异性 实验原理实验原理 酶具有高度的特异性 一种酶只能催化一种化合物或某一类化合物 如淀粉酶 只能催化淀粉水解 而不能使蔗糖水解 本实验以唾液淀粉酶分别对淀粉及蔗糖的不同作用 来说明酶的特异性 实验试剂实验试剂 1 唾液淀粉酶的制备 用烧杯取蒸馏水或自来水 含于口中 1 2 分钟后 吐入 50mL 烧杯中 备用 2 0 3 NaCl 的 0 5 淀粉液 3 0 5 蔗糖液 4 Benedict 试剂 A 取 CuSO417 3g 溶于 100mL 热蒸馏水中 冷后稀释至 150mL B 取柠檬酸钠 173g 及 Na2CO3 无水 100g 加水 600mL 加热使之溶解 冷后稀释至 850mL C 将 A 液缓慢注入 B 液中 混匀备用 可长期保存 实验步骤实验步骤 1 取试管两支 一支加入 0 5 淀粉液 2mL 另一支加入 0 5 蔗糖液 2mL 2 于两支试管中各加入制备好的唾液 1mL 3 将两支试管同时放入 37 恒温水浴箱中保温 4 15 分钟后 取出两试管 各加入 Benedict 试剂 1mL 5 将两试管同时放入沸水中煮沸 6 分钟 6 取出两试管 观察记录颜色的变化 并注意有无红色沉淀产生 为什么 二 温度对酶活性的影响 二 温度对酶活性的影响 实验原理实验原理 酶促反应同一般化学反应一样都需要在一定的温度下进行 使酶促反应速度最大时的温度称为此 酶的最适温度 低于此温度 酶促反应速度缓慢 高于最适温度 酶蛋白变性失活 本实验以入唾液淀 粉酶在不同温度下分解淀粉为例 说明温度对酶活性的影响 实验试剂实验试剂 1 唾液淀粉酶的制备 用烧杯取蒸馏水或自来水 含于口中 1 2 分钟后 吐入 50mL 烧杯中 备用 2 0 3 NaCl 的 0 5 淀粉液 3 KI I 溶液 实验步骤实验步骤 1 取三支试管并编号 同时各加入 5mL0 5 淀粉液及 1mL 唾液混匀 2 将管 1 管 2 管 3 同时分别放入冰浴 37 水浴 沸水浴中 4 3 15 分钟后 取出各管 分别加入碘液数滴 观察并记录各管颜色变化 并解释此现象 三 三 pH 对酶活性的影响对酶活性的影响 实验原理实验原理 在一定条件下 酶活性最高时的 pH 值称为最适 pH 偏离此 pH 酶活性就会有所下降 不同酶的 最适 pH 不同 例如 胃蛋白酶的最适 pH 为 1 5 2 5 胰蛋白酶的最适 pH 为 8 等 本实验以入唾液淀粉酶 最适 pH6 8 在不同 pH 条件下水解淀粉为例 说明 pH 对酶活性的影响 实验试剂实验试剂 1 唾液淀粉酶的制备 用烧杯取蒸馏水或自来水 含于口中 1 2 分钟后 吐入 50mL 烧杯中 备用 2 pH1 5 溶液 取 0 2M Na2HPO4 2H2O 溶液 41 2mL 加入 0 1M 柠檬酸 38 8mL 然后用浓 HCl 调至 pH1 5 左右 2 pH6 8 溶液 取 0 2M Na2HPO4 2H2O 溶液 61 8mL 加入 0 1M 柠檬酸溶液 18 2mL 3 pH9 8 溶液 取 0 2M Na2HPO4 2H2O 溶液 77 8mL 加入 0 1M 柠檬酸溶液 2 2mL 然后用 0 1N NaOH 调至 pH9 8 实验步骤实验步骤 1 取试管 3 支并编号 如下表加入各试剂 2 3 支试管同时放入 37 恒温水浴箱内保温 3 15 分钟后 取出 3 支试管 分别加入碘试剂数滴 每加 1 滴 注意摇匀 观察并记录颜色变化 试管号 0 5 淀粉 pH1 5 溶液 pH6 8 溶液 PH9 8 溶液 唾液 1 2mL 1mL 0 0 1mL 2 2mL 0 1mL 0 1mL 3 2mL 0 0 1mL 1mL 5 实验四实验四 淀粉酶活性的测定淀粉酶活性的测定 实验目的 实验目的 本实验的目的在于掌握分别测定这两种淀粉酶的方法 实验原理 实验原理 淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖 可用3 5 二硝基水杨酸试剂测定 由于麦芽糖能将3 5 二硝基 水杨酸还原生成3 氨基 5 硝基水杨酸的显色基团 在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比 故可 求出麦芽糖的含量 以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小 实验材料 仪器和试剂 实验材料 仪器和试剂 1 实验材料 萌发的小麦 芽长1厘米左右 2 仪器 722 分光光度计 天平 离心机 水浴锅 研钵 容量瓶 试管 移液管 三角瓶 漏斗 3 试剂 1 淀粉溶液 0 4 N NaOH PH5 6的柠檬酸缓冲液 3 5一二硝基水杨酸 麦芽糖标准液 操作步骤 操作步骤 1 酶液的提取 称取2克萌发的小麦种子 芽长1厘米左右 置研钵中加一克石英砂 磨成匀浆倒入50 毫升容量瓶中 用蒸馏水稀释至刻度 摇匀 离心6000转 分钟 取上清液备用 2 a 及 淀粉酶总活性的测定 取上述酶液2 6毫升 放入容量瓶中 用蒸馏水稀释至100毫升 稀释 程度视酶活性大小而定 混合均匀后 取4支试管 2支为对照 2支为测定管 各加入稀释之酶液1毫 升及1毫升Ph5 6之柠檬酸缓冲液 以下步骤重复a 淀粉酶测定的第 4 及 5 的操作 同样准备糖的 测定 3 酶促反应液的制备 取 4 只试管标号 按下表加入试剂 反应时间要准确 4 标准麦芽糖及酶水解液中麦芽糖含量的测定 按下表加入试剂 试剂 管号 酶液 1 1 1 1 缓冲液 1 1 1 1 aOH 0 4 M 4 4 0 0 50 0C 预保温 10min 淀粉液同时保温 1 淀粉液 2 2 2 2 50 0C 准确保温 5min aOH 0 4 M 0 0 4 4 试剂 ml 管号 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖 0 0 2 0 6 1 0 1 4 1 8 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 蒸馏水 2 0 1 8 1 4 1 0 0 6 0 2 0 0 酶解液 2 0 2 0 2 0 2 0 3 5 二硝基水杨酸 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 520nm 吸光值 6 将上表中试剂加完后 充分混匀 放入沸水浴中准确煮沸5分钟 取出冷却 用蒸馏水稀释至25毫 升 用分光光度计在520um波长下进行比色 记录消光值 以消光值为纵坐标 以麦芽糖含量为横坐标 绘制标准曲线 将酶水解液测定的消光值在麦芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量 然后进行结果计算 结果与计算 结果与计算 a 淀粉酶总活性 麦芽糖 毫克 鲜重 克 分钟 B B 样品稀释总体积 样品重 克 C B一 a 淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量 B一 a 淀粉酶的对照管中麦芽糖量 C一比色时所用样品液毫升数 实验实验五五 植物材料植物材料中中维生素维生素 C C 含量的测定含量的测定 染料滴定法染料滴定法 实验目的 实验目的 本实验要求学生掌握染料滴定法测定维生素 C 的原理和方法 实验原理 实验原理 维生素 C 在体内是一种较强的还原剂 利用染料 2 6 二氯酚靛酚作氧化剂 可将还原态的维生素 C 氧化成脱氢维生素 C 而染料本身还原成无色的衍生物 2 6 二氯酚靛酚在酸性条件下呈红色 在 滴定终点之前 滴下的 2 6 二氯靛酚立即被还原成无色 当溶液从无色转变成微红色时 即为滴定终 点 实验材料 仪器和试剂 实验材料 仪器和试剂 1 实验材料 水果或蔬菜 2 仪器 天平 微量滴定管 研钵 容量瓶 移液管 三角瓶 漏斗 3 试剂 1 2 草酸 2 0 001N2 6 二氯酚靛酚钠溶液 操作步骤 操作步骤 1 样品的处理和提取 称取 4 0 克新鲜样品 置研钵中 加 5 毫升 2 草酸 研成匀浆 通过漏 斗将样品提取液转移到 50 毫升时瓶中 残渣再用 2 草酸提取 2 3 次 提取液及残渣一并转入量瓶中 最后以 2 草酸定容 摇匀 过滤 滤液待测 2 空白 样品的测定 吸取滤液 10 毫升 放入 50 毫升三角瓶中 立即用 2 6 二氯酚靛酚钠溶 液滴定到出现明显的粉红色在 15 秒内不消失为止 记录所用滴定液体积 再重复二次 3 测定 取 2 草酸 10 毫升 放入别一 50 毫升三角瓶内 用 2 6 二氯酚靛酚钠滴定到终点 记录染料用量 平行两份 7 结果与计算 结果与计算 V1 V2 K V X 100 W V3 式中 X 100 克样品所含维生素 C 毫克数 毫克 100 克 W 称取样品重 克 V1 滴定样品所用染料毫升数 V2 滴定空白所用染料毫升数 V3 样品测定时所用滤液毫升数 即 10 毫升 V 样品提取液稀释之总体积 即 50 毫升 K 1 毫升染料液所能氧化维生素 C 之毫克数 可由标定算出 实验实验六六 血红蛋白凝胶过滤层析血红蛋白凝胶过滤层析 实验目的实验目的 通过本实验学习凝胶过滤层析的操作技术 掌握凝胶过滤层析的原理及其应用 实验原理实验原理 凝胶过滤 gel filtration 是一种利用凝胶按照分子大小分离物质的层析方法 又称分子筛层析 molecularsieve chromatography 或排阻层析 exclusion chromatography 1 凝胶介质 目前常用于凝胶过滤的的凝胶类介质主要有4大类 即葡聚糖凝胶 商品名 Sephardex 琼 脂糖凝胶 商品名 Sepharose 和聚丙烯酰胺凝胶 商品名 bio gel 和琼脂糖 聚丙烯酰胺混合凝 胶等层析介质 它们都是不溶于水的高聚物 内部有很微细的多孔网状结构 以Sephardex为例 它是 由一定平均分子量的葡聚糖与环氧氯丙烷交联生成的高聚物 网眼的大小由葡聚糖的分子量与环氧氯 丙烷的用量来控制 葡聚糖的分子量越大 环氧氯丙烷用量越大 则交联度越大 凝胶的网眼越小 Sephadex有很强的亲水性 在水或缓冲液中能吸水膨胀 交联度越大 网眼越小 吸水量也越少 实 际工作中常用每克干胶吸水量 mL 的10倍 G值 表示葡聚糖凝胶的交联度 可根据被分离物质分 子的大小和工作目的 选择适合的凝胶型号 2 凝胶过滤的原理 凝胶过滤层析 凝胶过滤 是把样品加到充满凝胶颗粒的层析柱中 然后选择适当的缓冲液进行 洗脱 凝胶本身是一种分子筛 凝胶颗粒有一定得孔径 它可以把待分离样品按分子大小不同进行分 离 好像过筛 可以把大颗粒与小颗粒分开 但这种过筛与普通的筛子不同 凝胶过滤的主要装置是填 充有凝胶颗粒的层析柱 将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡 使其充分吸收膨胀 然后装入层析柱中 加入欲分离的混合物 然 8 后在用同一溶剂洗脱 在洗脱过程中颗粒直径接近和大于凝胶颗粒网孔直径的大分子 不能进入凝胶 颗粒中的静止相 只能留在凝胶颗粒之间的流动相中 因此先流出层析柱 反之 小分子则可自由出 入凝胶颗粒 因而流速慢以至最后流出柱外 从而使样品中分子大小不同的物质得到分离 本实验利用凝胶过滤的特点 先向层析柱中加入FeSO2溶液 形成一个还原带 然后加入血红蛋白 样品 血红蛋白与高铁氰化钾的混合液 由于血红蛋白分子量大 在凝胶床中流速快 当其流经还 原带时 褐色的高铁血红蛋白立即变为紫红色的亚铁血红蛋白 亚铁血红蛋白继续下移 与缓冲液溶 解的O2结合 形成鲜红色的氧合血红蛋白 铁氰化钾是小分子量化合物 呈黄色带远远地落在后边 这样 就可以形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果 3 凝胶过滤的优点及用途 凝胶过滤的操作条件温和 适于分离不稳定的化合物 凝胶颗粒不带电荷 不与被分离物质发生 反应 因而溶质回收率接近100 而且设备简单 操作方便 分离效果好 重现性强 凝胶柱可反 复使用 所以 凝胶过滤常用于测定相对分子质量 脱盐 蛋白质等大分子的分离纯化 实验仪器及试剂实验仪器及试剂 1 仪器 层析柱 Lcm x 40cm 真空泵 真空干燥器 抽滤瓶 恒温水浴 2 试剂 1 磷酸缓冲液 PH 7 0 称取Na2HPO4 2H2O 2 172g NaH2PO4 2H2O 1 076g 溶于蒸馏水中 定容至1000mL 2 Na2HPO4 EDTA Na2溶液 称取 2 69g EDTA Na2 3 56gNa2HPO4 2H2O 加蒸馏水溶解 并定容至100mL 3 40m mol L FeSO4溶液 称取FeSO4 7H2O 1 11g溶于100mL水中 用时现配 4 Sephadex G 2 5 5 固体铁氰化钾 K3Fe CN 6 6 抗凝血 实验步骤实验步骤 1 凝胶溶胀 取10g SePhadex G 25 加200mL蒸馏水充分溶胀 在室温下约需6小时或在沸水浴 中溶胀5小时 待凝胶溶胀平衡后 用倾泻法除去细小颗粒 再加入与凝胶等体积的pH 7 0 磷酸缓冲液 在真空干燥器中减压除气 准备装柱 2 装柱 将层析柱垂直固定 旋紧柱下端的螺旋夹 在柱内加入少量磷酸缓冲液或直接把处理好 的凝胶连同适当体积的缓冲液用玻棒搅匀 然后边搅拌边倒入层析柱中 同时开启螺旋夹 控 制一定流速 最好连续装完凝胶 若分次装入 需用玻棒轻轻搅动柱床上层凝胶 以免出现界 面影响分离效果 装柱后形成的凝胶床至少长30cm 使胶床表面保持2 3cm液层 注意 整个操作过程中凝胶必须处于溶液中 不得暴露于空气 否则将出现气泡和断层 应当重新 装住 3 平衡 继续用磷酸缓冲液洗脱 调整缓冲液流速 平衡20 30分钟 4 样品制备 1 取1m鸡的抗凝血放入小烧杯中 加5mL pH7 0的磷酸缓冲液 再加入27 5 mg K3Fe CN 6 固体 9 用玻棒搅动使其溶解 即得褐色的高铁血红蛋白溶液 2 吸取 lmL FeSO4溶液和 lmL EDTA Na2 NaHPO4溶液 于小烧杯中混匀 注意 还原剂混 合液要新鲜配制 尽可能缩短其与空气接触的时间 5 上样 旋开层析柱上端旋扭 待胶床上部的缓冲液几乎全部进入凝胶 即缓冲液液面与胶床平 面相切 时 立即加入0 4mL上述混合液 待其进入胶床表面仅留约 lmm液层时 加入 0 5mL 缓冲液 再当胶床表面仅留约 lmm液层时 吸取0 5mL血红蛋白样品溶液 小心地注入层析柱 胶床面中央 注意切勿冲动胶床 慢慢打开螺旋夹 待大部分样品进入胶床 床面上仅有lmm 液层时 用乳头滴管加入少量缓冲液 使剩余样品进入胶床 然后用液管小心加入3 5cm高的 洗脱缓冲液 6 洗脱 继续用磷酸缓冲液洗脱 调整流速 使上下流速同步保持每分钟约6滴 7 凝胶的回收 实验完毕用洗脱液把柱内有色物质洗脱干净 保留凝胶柱重复使用或回收凝胶 实验结果实验结果 1 观察并记录实验现象 实验实验七七 过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验目的实验目的 1 使学生掌握聚丙烯酸徽凝胶垂直板电泳的原理和操作技术 学会从植物材料 小麦幼苗 分离过氧化物酶同工酶 2 根据酶的生物化学反应 通过染色方法显示出酶的不同区带 签定 小麦幼苗过氧化物酶同功酶 实验原理实验原理 同工酶是催化同一种化学反应 但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶 同工酸 与生物的遗传 生长发育 代谢调节及抗性等都有一定关系 测定同工酶在理论上和实践上都具有 重要的意义 本实验测定的过氧化物酶是植物体内普遍存在的 活性较高的一种酶 它与植物的光 合 呼吸作用以及生长素的氧化等有关 在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化 因此 测 定过氧化物酶的生物活性或其同工酶可以了解某一时期植物体内代谢的变化 1 电泳 带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动 这种现象称为电泳 多年来 电泳作 为一项有效的分析 分离和制备技术发展很快 在生产 科研和医疗工作中得到了广泛应用 利 用电泳技术分离 分析蛋白质 酶 核酸等生物大分子 有较高的分利率 目前已成为生物科学 研究中必不可少的手段之一 2 电泳具有的特点 凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离 并可进行定性或定量分析 样品量极少 设备简单 操作简便 分辨率高 便于观察 记录和保存 3 聚丙烯酰胺凝胶的合成及特点 聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamid gel electrophoresis PACE 是以聚丙烯酸胺凝胶作为载体的一种 区带电泳 这种凝胶是由丙烯酰胺单体 Acrylamide Acr 和交联剂N N 甲叉双丙烯酰胺N N 一 10 Methylene bisacrylamide Bis 在引发剂和催化剂的作用下聚合而成的 化学聚合的引发剂是过硫酸铵 Ap 在形成中提供自由基 通过自由基传递 使丙烯酰胺成为自 由基 发动聚合反应 催化剂是四甲基乙二胺 Tetramethyl ethylenediamine TEMED 则可加快引发剂 释放自由基的速度 具体反应是过硫酸铵在水溶液中形成一个过硫酸自由基 此自由基可以激活 TEMED TEMED作为一个电子载体提供一个未配对电子将丙烯酰胺单体转换化成丙烯酰胺自由基经反 应多聚物聚合成网状结构的凝胶状 其网状孔径大小由聚合条件及单体浓度决定 光聚合以核黄素 即VB2 作为引发剂 需要强光照射反应液和有痕量氧存在下进行 核黄素经光 解形成无色基 无色基被氧再氧化成自由基 从而引起聚合作用 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定 每100毫升凝胶溶液中含有的单体 Acr 和 交联剂 Bis 总克数称为凝胶浓度 用T 表示 凝胶溶液中 交联剂 Bis 占单体 Ac r 和交联 剂 Bis 总量的百分数称为交联度 用C 表示 改变凝胶浓度 T 和交联度 C 可获得不 同密度 粘度 弹性 机械强度和孔径大小的凝胶 以便适应各种样品的分离 4 聚丙烯酸胺凝胶电泳的装置 电泳仪由两部分组成 即稳压稳流直流电源和缓冲液贮存系统 电泳槽 板状电泳槽是目前 使用最多的电泳槽 凝胶在两块平行的玻璃板中间 因而称板状电泳 slabelectrophoresis 板状 电泳最大的优点是包括标准相对分子质量蛋白质在内的多个样品可以在同一块凝胶上在相同的条 件下进行电泳 便于利用各种鉴定方法 直接比较各样品的区带 保证结果的准确可靠 还可以进 行双向电泳 另外 板状电泳易散热 其结果便于照相和制干胶 板状电泳槽有垂直板和水平板电 泳槽 实验材料 仪器及试剂实验材料 仪器及试剂 1 材料 小麦幼苗 2 仪器 电泳仪一套 稳压电源及圆盘电泳槽 高速冷冻离心机 10000r 电冰箱 量筒 烧杯 注射器 注射针头 玻璃板2块 样品瓶 染色槽 移液管 离心管 试管架 玻璃棒 等 3 试剂 琼脂糖 HCl TEMED Tris Acr Bis 过硫酸铵 核黄素 甘氨酸 蔗糖溴酚蓝 联 苯胺 贮液配制见附表 实验步骤实验步骤 1 凝胶的制备 1 将贮液由冰箱取出 待于室温平衡后再配制工作表液 2 安装玻璃板 3 按下表比例配制分离胶 11 表表 10 2 配制分离胶比例配制分离胶比例 4 制板 选取洗净烘干的玻璃板垂直放入制胶玻璃架上 玻璃板底部封闭 封闭的方法根据具体条 件而定 5 灌分离胶 1 2号液和重蒸水放一烧杯 3号液放另一烧杯 然后小心混合两杯溶液 用长滴管取 混合的溶液 沿板壁加入胶液距矮玻璃板上端2cm再加水至矮玻璃板 刚加过水可看出界面 后逐 渐消失 等在看出界面时 表明分离胶已聚合 再静置20 30分钟 倒出水层 正常情况10min 开始聚合 应控制在30min 1h内聚合完成 6 浓缩胶的制备 按下表比例配