Elisa技术原理及应用.pptx

上海启因生物科技有限公司 Elisa原理及应用简介 Enzyme LinkedImmunosorbnentAssay 启因生物日期 2017 08 18 上海启因生物科技有限公司 上海启因生物科技有限公司 ELISA的发展 ELISA是酶联接免疫吸附剂测定 Enzyme LinkedImmunosorbnentAssay 的简称 其是继免疫荧光 IFA 和放射性免疫 RIA 分析技术之后 建立起来的用酶来标记抗原或抗体的分析技术 自上世纪70年代初问世以来 发展十分迅速 目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域 上海启因生物科技有限公司 ELISA的原理 定义 以免疫学反应为基础 将抗原 抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种检测未知抗体或抗原的敏感性很高的试验技术 反应的基础 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记 结合在固相载体的抗原或抗体仍保持其免疫学活性 而酶标记的抗原或抗体既保持其免疫学活性又保留酶的活性 加入酶反应的底物后 底物被酶催化成为有色产物 产物的量与标本中受检物质的量直接相关 由此进行定性或定量分析 上海启因生物科技有限公司 ELISA的原理 抗原 定义 抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质 抗原进入机体后 可刺激机体引起细胞免疫和产生抗体 能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质 例如完整的病毒粒子 细菌等 小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的 称为半抗原 例如某些激素 药物等 抗原的反应性取决于抗原决定簇 或称为表位 一个抗原分子可带有不同的决定簇 例如细菌的荚膜多糖 类脂中可带有多个抗原决定簇 上海启因生物科技有限公司 ELISA的原理 抗体 定义 抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白 Ig Ig分五类即IgG IgA IgM IgD和IgE Ig由两个轻链L和两个重链H的单体组成 Ig的轻链是相同的 有 和 两种型别 五类Ig的重链结构不同 这决定了它们的抗原性也不同 特点 可逆性 抗原抗体的结合是动态平衡过程 特异性 抗原抗体化学结构互补 高度特异 最适比例 抗原抗体的含量应保持最适合的比例 敏感性 标记的免疫敏感度可达ng ml 上海启因生物科技有限公司 ELISA的原理 ELISA方法中三个必要的试剂 固相的抗原或抗体 即 免疫吸附剂 immunosorbent 酶标记的抗原或抗体 称为 结合物 conjugate 酶反应的底物 可设计出各种不同类型的检测方法 上海启因生物科技有限公司 ELISA的检测类型 固相载体具有较强的吸附蛋白质的性能 抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性 聚苯乙烯ELISA反应中最常用的固相载体 具有较强的吸附蛋白质的性能 在ELISA测定过程中 它作为载体和容器 不参与化学反应 抗原 抗体和其它生物分子通过多种机制吸附至载体表面 这包括通过疏水键 流水 离子键的被动吸附 通过引入其它活性基团如氨基和碳基的共价结合 以及通过表面改性后的亲水键结合 聚氯乙烯 聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高 但空白值也略高 良好的ELISA板应该是吸附性能好 空白值低 孔底透明度高 各板之间 同一板各孔之间 同一板各孔之间性能相近 固相载体 上海启因生物科技有限公司 ELISA的检测类型 概念 将抗原或抗体固定在固相载体的过程称为包被 coating 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的 靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用 这种物理吸附是非特异性的 受蛋白质的分子量 等电点 浓度等的影响 大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团 故更易吸附到固相载体表面 包被的方式 上海启因生物科技有限公司 ELISA的检测类型 ELISA常用酶 上海启因生物科技有限公司 ELISA的检测类型 实验基本流程图 上海启因生物科技有限公司 ELISA的检测类型 双抗夹心法 双抗体夹心法测抗原和双抗原夹心法测抗体间接法测抗体 常用 竞争法 竞争法测抗原与竞争法测抗体捕获包被法测抗体亲和素 生物素ELISA法 上海启因生物科技有限公司 ELISA的检测类型 双抗体夹心法测抗原 特异性抗体与固相载体连接 形成固相抗体 标本中的抗原与固相载体上的抗体结合成固相抗原复合物 加酶标记抗体 使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合 酶量与标本中受检物质的量成正相关 加底物 夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物 根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量 上海启因生物科技有限公司 ELISA的检测类型 双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物 此法中受检标本不需稀释 可直接用于测定 因此其敏感度相对高于间接法 乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法 本法关键在于酶标抗原的制备 应根据抗原结构的不同 寻找合适的标记方法 上海启因生物科技有限公司 ELISA的检测类型 间接法测抗体 间接法是检测抗体常用的方法 其原理为利用酶标记的二抗 抗人免疫球蛋白抗体 以检测与固相抗原结合的受检抗体 故称为间接法 其检测方法 固相 包被 抗原Ag 样品 抗体Ab 酶标二抗Ab Ag Ab 抗Ab 底物 TMB 显色 上海启因生物科技有限公司 ELISA的检测类型 竞争法测抗体 原理 标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合 标本中抗体量越多 结合在固相上的酶标抗体愈少 因此阳性反应呈色浅于阴性反应 固相 包被 抗原Ag 样品 抗体Ab 酶标抗体Ab Ag Ab 底物 TMB 不显色 固相 包被 抗原Ag 样品 无抗体Ab 酶标抗体Ab Ag Ab 底物 TMB 显色 上海启因生物科技有限公司 ABS ELISA法 ELISA的检测类型 固相支持物 样品 特异性IgG 生物素化抗小鼠IgG Biotin 辣根过氧化物酶HRP 酶标链亲和素 Avidin DAB显色液 显色 ABS 亲和素 avidin 生物素 biotin 系统 system 亲和素与生物素的结合 虽不属于免疫反应 但特异性强 亲和力大 能够形成一种极为稳定的复合体 把亲和素和生物素与ELISA偶联起来 可以大大提高ELISA的敏感度 上海启因生物科技有限公司 ELISA检测 ELISA特点 灵敏度高 ELISA测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶 由于酶的催化效率很高 很少量的酶即可诱导大量的催化反应 产生可供观察的显色反应 间接地放大了免疫反应的结果 使测定方法达到很高的敏感度 特异性强 ELISA的特异性来自抗体或抗原的选择性 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间 由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系 所以抗原抗体反应具有高度的特异性 准确性高 检测时间短 价格低廉 判断结果有客观标准 结果便于记录和保存等优点 适合于大批标本的检测 广泛应用于食品安全检测 医疗检测以及免疫实验分析等领域 上海启因生物科技有限公司 ELISA应用前景 免疫酶染色各种细胞内成份的定位研究抗酶抗体的合成显现微量的免疫沉淀反应定量检测体液中抗原或抗体成份 ELISA在生物医学领域的应用范围四个方面 上海启因生物科技有限公司 ELISA应用前景 ELISA在检测抗原方面 在实际应用方面 可作疾病的临床诊断 疾病监察 疾病普查 法医检查 兽医及农业上的植物病害的诊断检定等 检查抗原和半抗原方面 在内分泌方面用于检测雌性激素 绒毛膜促性腺激素 黄体素 胰岛素 皮质醇 促甲状腺素和孕酮等在血液学方面 可用于检查凝固因子 如第 凝固因子 红细胞抗原及结合球蛋白 HaptoGlobin 等在肿瘤方面 试用检查甲胎蛋白 AFP 癌胚抗原 CEA 对前者的敏感性已达到与放射免疫试验相当的水平 但对CEA检查的敏感性较低 目前尚不能用于常规诊断在传染病的诊断方面 用于检查乙型肝炎表面抗原 其他方面 尚有用于检查霍乱弧菌 大肠肝菌 绿脓杆菌和破伤风梭菌毒素 脑膜炎球菌及淋球菌抗原 检查免疫抑制病人中常见的白色念殊菌抗原 检查病人或病兽的粪便中的轮状病毒 自病人标本中检查甲肝病毒 疱疹病毒 麻疹病毒 流感 呼吸道融合及巨细胞病毒等 上海启因生物科技有限公司 ELISA应用前景 ELISA在检测抗体方面 寄生虫病方面 用于对疟原虫 阿米巴 利日曼原虫 锥虫 血吸虫 囊虫 弓浆虫 肺吸虫 肝吸虫 血丝虫 旋毛虫病等血清学诊断 这对人医和兽医都很重要 病原微生物方面 已用于检查链球菌 沙门氏菌 布氏杆菌 结核杆菌 麻疯杆菌 霍乱弧菌 淋球菌 假丝酵母菌等的抗体 还可用于破伤风抗毒素和霍乱弧菌抗毒素的测定以及检测斑疹伤寒立克次氏体感染后的抗体 可作诊断 试用于病毒抗体检查报告的有 流感病毒 腮腺炎病毒 麻诊 风疹 轮状病毒 疱疹病毒 巨细胞病毒 EB病毒 腺病毒 肠道病毒 脑炎病毒 黄热病毒 狂犬病毒和脊髓灰质炎病毒等 其敏感性都超过目前常用的检查方法 卫生学方面 可用于检测食品中葡萄球菌肠毒素及沙门氏菌毒素等等 上海启因生物科技有限公司 样品类型 血清 血浆 尿液 胸腹水 脑脊液 细胞培养上清 组织匀浆等 种属 人检测周期 收到样品起