PCR-DGGE技术.ppt

聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳PCR DGGE PolymeraseChainReaction DenaturingGradientGelElectrophoresis 汇报人 学号 环境微生物新技术 目录 一 DGGE的简介 二 DGGE的定义 三 DGGE的基本原理 四 PCR DGGE的操作流程 五 DGGE的优缺点 六 DGGE的应用 变性梯度凝胶电泳 denaturedgradientgelelectrophoresis DGGE 最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的 起初主要用来检测DNA片段中的点突变 Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究 后来又发展出其衍生技术 温度梯度凝胶电泳 temperaturegradientgelelectrophoresis TGGE 此后十年间 该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域 目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一 一 DGGE简介 DGGE denaturinggradientgelelectrophoresis 即变性梯度凝胶电泳 是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化 从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开 具体而言 就是将特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳 随着电泳的进行 DNA片段向高浓度变性剂方向迁移 当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处 双链DNA形成部分解链状态 这就导致其迁移速率变慢 由于这种变性具有序列特异性 因此DGGE能将同样大小的DNA片段很理想地分开 它是一种很有用分子标记方法 二 DGGE的定义 使用对象 长度相同但序列不同的DNA片段变性剂 尿素和甲酰胺DGGE不是将分子量不同的DNA分开 而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同 将序列不同的DNA分开 原理 根据DNA的解链特性 不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同 混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时 当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时 相对应的DNA发生解链变性 导致电泳迁移速率降低 由于泳动受阻DNA分子在凝胶中的停留位置不同 从而使不同DNA分子得以分离 三 DGGE的基本原理 DGGE是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统 核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链 称之为变性 核酸50 发生变性时的温度称为熔解温度 Tm Tm值取决于DNA分子中G C含量的多少 DGGE将凝胶设置在双重变性条件下 温度50 60 变性剂0 100 DGGE的成功有赖于双链DNA内部低温解链部分变性后迁移率的改变 但在相当于最高Tm的变性剂浓度的位置 相应的DNA片段可能全部解链 使实验无法检出存在于高TmDNA片段中的碱基替换 为了解决此问题 可以在一个PCR引物的5 端设计一段富含G C的尾巴 从而使扩增产物富含G C碱基对 30 40bp 保证了绝大多数DNA片段不会发生完全解链 在最高变性剂浓度区域仍然可以分辨出部分解链的异源双链 这一改进使DGGE的突变检出率接近100 三 DGGE的基本原理 根据变性剂梯度方向的不同 DGGE可分为 垂直DGGE和平行DGGE 1 垂直DGGE 变性剂梯度与电场方向垂直 常用于试验决定分离型 野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围 2 平行DGGE 其变性剂的梯度和电场方向平行 主要用于解链范围明确的DNA片段的检测 DGGE的分类 环境样品基因组DNA的提取 目标片段的PCR扩增 DGGE图谱的分析 图像的采集和条带的回收 DGGE分析 电泳前准备工作 电泳分析 剥胶 染色 DGGE条带测序 四 PCR DGGE分析微生物群落的主要步骤 总DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基础 适合的DNA提取方法对环境样品微生物群落结构分析非常重要 适合DNA提取方法的考量 DNA的得率 能否进行PCR扩增以及扩增的重复性 制备DNA花费时间的长短 关于DNA提取的建议 优先考虑基于原位裂解的方法 根据实际情况采用酶解 酚氯仿抽提法 或者DNA提取试剂盒 建议购买Qiagen公司相关产品 1环境样品基因组DNA的提取 选择适合的目标片段 设计合适的引物 注意有GC夹子情况下引物二聚体的行程 环境样品目标片段的扩增最好采用TouchdownPCR 注意PCR的环境 V3区产物扩增极易污染 2目标片段的PCR扩增 DGGE的操作流程主要有 制胶点样电泳显色成像分析 3DGGE分析 1 DGGE前的准备工作从这一步开始 带上手套 1 配置试剂时一定要用去离子水 可以配置不同梯度的变性溶液备用 注意变形溶液中大颗粒的过滤及脱气 2 制胶洗膜时用的各个容器要用去离子水洗涤干净 以防止氯离子污染 3 灌胶前准备好所有需要的东西 试剂 枪头 甚至物品摆放的位置 4 制胶是实验的关键 在往玻璃板中灌胶时要匀速地转动滑轮 将凝胶液匀速地灌入玻璃板 5 灌胶后立刻清洗注射器 以防丙烯酰胺凝固 堵塞管子 3DGGE分析 2 电泳上样的胶孔要用去离子水冲洗干净并吸干 PAGE胶装入电泳支架时注意用去离子水润滑橡胶垫 装入后在胶孔中加入缓冲液 上样时上样器要深入胶孔底部 尽量在同一个胶上比较所有样品 每一个胶上要有markerlane 将胶放入电泳槽中时注意正负极 建议低电压电泳一段时间 在样品完全进入胶中之后再升电压 3DGGE分析 3 剥胶与染色停止电泳后注意把电泳仪调零之后在关闭电源剥胶需要细致 用好去离子水和保鲜膜 染色前做好胶样品顺序的标记 通过各种染色方法可以看到DGGE胶中的DNA条带 一般有银染 EB染色和SYBRGreen染色 3DGGE分析 EB法染色的灵敏度最低 SYBRGreenI和SYBRGold相比EB 能更好地消除染色背景 此它们的检测灵敏度比EB法高很多 EB和SYBR染色时 双链DNA能很好地显色 单链DNA基本上不能显色 银染法的灵敏度最高 它不但能染双链DNA 也能染单链DNA 它的缺点是不能用于随后的杂交分析 获得高质量的DGGE图谱 DGGE条带的回收 注意紫外条件下操作的安全 尽量减少DNA在紫外下的照射时间 不同长度目标片段从切胶条带中的回收 测序注意要点 回收条带的DNA在PCR扩增后 一定要克隆 确认克隆与母条带可以跑到同一个位置后 再送去测序 每个条带至少测3个克隆 4图像的采集和条带的回收 DGGE图谱的聚类分析 相似性分析 DGGE胶通过扫描仪输入计算机 通过MolecularAnalysis软件进行相似性分析 通过DGGE后得到的指纹图谱 每一个条带代表某个微生物优势菌群 通过测序和序列比对 可以得出此优势菌群的种类 5图DGGE图谱的分析 DGGE图谱的主成分分析 5图DGGE图谱的分析 DGGE图谱的数字化 Quantityone 5图DGGE图谱的分析 多样性指数的计算 5图DGGE图谱的分析 用QuantityOne Bio Rad USA 软件对DGGE图谱进行数字化处理 按照如下公式计算多样性指数 Shannon Wienerindex 其中 s代表每泳道中的条带数量 Pi为泳道中第i条带灰度 heightofthepeak 占该泳道总灰度的比例 菌群均匀度 evenness E E H H max H max lnS 优点 1 DGGE的最大优点就是无需进行微生物培养 且能检测出难以或不能培养的微生物 同时检测多种微生物 2 突变检出率高 DGGE的突变检出率为99 以上几乎可以检出所有突变 3 可将突变分子完好无损地同野生型分子分开用于进一步的分析 4 无须标记 DGGE不需同位素掺入 可避免同位素污染及对人体造成的伤害 5 操作简便 快速 重复性好 结果准确可靠 电泳前只需一步操作 DGGE一般在24小时内即可获得结果 PCR DGGE方法则能客观完整地鉴定微生物 根据参考菌株和样品16SrRNA的PCR产物在凝胶中的相对位置来进行判断 若割胶测序 然后序列比对 就可以得出遗传相关性 6 可用于未经扩增的基因组DNA 可检测出象甲基化这样的DNA修饰 五 DGGE的优缺点 缺点 1 只能分离较小的片段 500bp 对于大片段的分离效率下降 2 DGGE图谱中单一的条带并不总是代表单一的菌株 或是在不同的泳道中移动到同一位置的条带可能由不同的细菌组成 3 DGGE通常显示群落中优势种类的rDNA片段 只有占整个群落细菌数量约l 或以上的类群能够通过DGGE检测到 4 由于某些种类的16SrDNA不同拷贝之间的多态性问题 可能导致自然群落中细菌数量的过多估计 5 DGGE技术对微生物的分类鉴定依赖于基因数据库 若数据库中基因序列信息不够丰富 将会限制DGGE的使用 6 需要专门设备 用计算机对序列进行分析 7 需要进行预实验昂贵的 GC夹板 用含有毒性物质甲酰胺的梯度凝胶 8 无法确定突变在DNA片段中位置 五 DGGE的优缺点 注意事项1 配置试剂时一定要用去离子水 制胶洗膜时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净 以防止氯离子污染 2 制胶是实验的关键 在往玻璃板中灌胶时 要匀速地转动滑轮 将凝胶液匀速地灌入玻璃板 3 灌完胶后