护心颗粒中人参和三七的皂苷成分的提取工艺研究

1 / 10护心颗粒中人参和三七的皂苷成分的提取工艺研究【摘要】 目的研究用乙醇溶液提取护心颗粒中人参和三七皂苷成分的工艺条件。方法以提取物中三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1 和 Rb1 的含量为评价指标，选择乙醇浓度、醇与药材量之比、提取时间及提取次数等为影响因素，进行 L9(34)正交实验，优化提取人参和三七皂苷成分的工艺条件。结果乙醇溶液提取人参和三七皂苷成分的最佳工艺条件为用 10 倍量于药材的 70%的乙醇溶液提取 3 次,每次提取 2 h。结论乙醇溶液提取人参和三七皂苷成分的工艺条件合理可行。 【关键词】 人参皂苷; 三七皂苷; 乙醇浸膏; 护心颗粒; 正交实验法Abstract：ObjectiveTo investigate the extraction condition of ginsenoside and notoginsenoside from Radix et Rhizoma of Ginseng and Notoginseng in Huxin granules with alcohol solution. MethodsThe orthogonal design was used for the extraction condition. With the contents of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1 and Rb1 as the evaluation indexes, evaluated the effects of the 2 / 10percent concentration of the alcohol. the ratio of the alcohol to herbal medicine material, the process time and the repeat times of extraction were The optimum conditions of extraction were as follows: the concentration of the alcohol 70%, the ratio of the alcohol to herbal medicine material 10:1, refluxing for 2 hrs, and repeat 3 times. ConclusionThe optimum condition of extraction is steady and feasible.Key words：Ginsenoside; Notoginsenoside; Alcohol Extractives; Huxin Fang granules ; Orthogonal Design Test护心方是我院心脏中心在邓铁涛 “五脏相关-心脾相关”理论指导下，以“调脾护心”为主要治则，用于冠心病血运重建(冠脉搭桥术或冠脉支架术)后的中医干预治疗的基础处方之一。经过多年临床应用，取得了良好的疗效14。护心颗粒是护心方经现代制剂技术精制而成。人参和三七含有的皂苷、黄酮、多糖、微量元素、维生素、有机酸等有效成分，是护心颗粒组方中起调脾护心,补益心气,化痰祛瘀的重要成分。提取人参和三七浸膏是制备护心颗粒的基础工艺之一。本研究采用正交实验法，以高效液相色3 / 10谱法测量浸膏中三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1 和 Rb1 的含量为评价指标，优选提取护心颗粒中人参和三七的皂苷成分的最佳工艺条件。现报道如下。1 仪器与材料仪器高效液相色谱仪: Waters600 型泵,717 型自动进样器, Waters 2998 二极管阵列检测器 (美国 Waters 公司);Empower pro system 色谱数据工作站;USC-320D 型超声波清洗器(上海波龙电子设备有限公司);电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏试验设备有限公);BS224S 型电子天平北京赛多利斯(Sartorius)仪器系统有限公司;R501 型旋转蒸发仪(上海中科机械研究所)。材料 生晒参产地吉林，三七产地云南，广州康美药业股份有限公司供应，并经刘茂贵主任中药师鉴定，分别为五加科植物人参 Panax ginseng C. A. Mey. 和五加科植物三七 Panax notoginseng (Burk.) Chen.的干燥的根及根茎，符合中国药典5各药项下的规定。 乙腈(色谱纯，DIMA 科技公司);乙醇(医用级，广东省广宁县葡萄糖药业有限公司);对照品三七皂苷 R1(批号 0745-200007)，人参皂苷 Rg1(批号 110703-XX24) 和人参皂苷 Rb1(批号110704-XX18)，均由中国药品生物制品检定所供应;其他试剂均为分析纯。2 方法与结果4 / 10正交实验设计 根据预试验和文献报道69，选取乙醇浓度、溶剂与药材用量之比、提取时间、提取次数等 4 个影响因素，每个因素选 3 个水平，按表 1 设计 L9(34)正交实验。 乙醇浸膏的提取 按照表 2 安排的实验条件，精密称量按处方比例混合的人参和三七药材粉末 45 g，加入计算量和规定浓度的乙醇溶液，回流提取规定的时间和次数后，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，浓缩近干，得稠膏。用 70%乙醇溶液解稠膏，转移至 250 ml 容量瓶中并稀释至刻度。每个实验重复两次。精密量取上述浸膏的 70%乙醇溶液 10 ml，置蒸发皿中，于水浴上蒸发至干，残留物用甲醇溶解，转移至 10 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，经 m滤膜过滤;精密量取 10 l，注入高效液相色谱仪，按“”项下的条件，测量三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1和 Rb1 的峰面积。计算 3 种皂苷的质量分数，3 种皂苷的质量分数之和;以两次试验的 3 种皂苷的质量分数之和为综合评分指标，每个水平对应的综合评分值之和 K1、K2、K3，极差值 R，列于表 2。方差分析结果见表 3 表 3 方差分析方差来源离差平方和(SSi)自由度()方差(MS)F 值显著性三七皂苷 R1、人参皂苷 Rb1 和 Rg1 的含量测定色谱条件色谱柱为 kromasil C18 柱( mm250 mm 5 / 10,5 m);以乙腈为流动相 A，水为 B，进行二元线性梯度洗脱：020 min，20%A80%B;2030 min,(20%35%)A(80%65%)B;3060 min，(35%20%)A(65%80%)B。检测波长 203 nm;流速为 mlmin-1;柱温为室温。对照品混合溶液的制备 精密称取对照品三七皂苷R1 mg、人参皂苷 Rg1 mg 和人参皂苷 Rb1 mg，置 5 ml量瓶中，用甲醇使溶解，稀释至刻度，摇匀，制备成对照品混合溶液。线性关系考察精密称取对照品混合溶液2，4，8，12，16，20 l，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积积分值为纵坐标，进样量(g) 为横坐标绘制标准曲线。三七皂苷 R1 在 g，人参皂苷 Rgl 在 g，人参皂苷 Rb1 在 g 之间呈良好的线性关系。其回归方程分别为：三七皂苷 R1:Y = 2105 7 104 , r = 8;人参皂苷 Rg1：Y =105 8104 , r = 9;人参皂苷 Rb1: Y = 5105 7104 , r = 9;图 1 三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1 的校正曲线精密度实验精密吸取同一对照品混合溶液 10 l，重复进样检测 6 次,记录峰面积，计算得到三七皂苷 R1 峰面积的相对标准偏差 RSD=%，人参皂苷 Rg1 峰面积的6 / 10RSD=%，人参皂苷 Rb1 峰面积的 RSD=%，3 种皂苷峰面积之和的 RSD=%。 结果表明测量实验精密度良好。稳定性实验精密吸取同一供试样品溶液 10 l ,分别于 0 ，2 ，4 ，6，8 和 10 h 时进样，测定峰面积。按“”项下的回归方程计算 3 种皂苷及它们之和的质量分数的 RSD(%)：三七皂苷 R1 质量分数的 RSD=%，人参皂苷 Rg1质量分数的 RSD=%，人参皂苷 Rb1 质量分数的 RSD=%，3 种皂苷质量分数之和的 RSD=%。结果表明，在测量时间 10 h 内，样品溶液稳定。正交实验的结果 表 2 中极差 R 值表明，影响因素主次为 DACB。表 3 的方差分析结果表明，影响因素主次为 CDAB。每次提取时间(P)。但是，对于人参和三七这样贵重药材，为了增加浸膏的产量和皂苷含量，减少水溶性杂质，增加醇溶性物质，使用 10 倍于药材量的 70%的乙醇比较好。因此，实验得到的最佳工艺条件应为A3B3C3D3，即用 10 倍于药材量的 70%乙醇水溶液，提取 3次，每次提取 2 h。提取工艺的验证 精密称量按处方比例混合的人参和三七药材粉末 45 g，共 3 份，采用优选的最佳工艺条件，进行提取工艺的验证。为了考察用 70%乙醇提取的效果，增加了第 4 次用 10 倍于药材量的水再提取 1 h。提取液按“”项下方法分别处理，并按照“”项下的条件，测量三7 / 10七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1 和 Rb1 的峰面积。按“”项下的回归方程计算 3 种皂苷及它们之和的平均质量分数和相对标准偏差(RSD%)。表 4 结果表明，优化的 A3B3C3D3 工艺条件具有可行和较好的重现性。 另外，精密称取人参药材粉末 2 g，共 3 份，分装于滤纸筒内，置于索氏提取器内，加氯仿 150 ml，回流提取3 h，取出纸筒，挥发除去氯仿，药渣连同纸筒一起放入100 ml 锥形瓶中，加 50 ml 用水饱和的正丁醇，放置过夜，称重， 超声处理 30 min，冷至室温，称重，用水饱和的正丁醇补充减失重量，滤过，精密量取续滤液 25 ml，置于蒸发皿中，在水浴上蒸发除去正丁醇，残留物用甲醇溶解，转移到 10 ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为人参药材供试溶液。再精密称取三七药材粉末 g，共 3 份。同法处理，制备成三七药材供试溶液。分别精密量取人参、三七药材供试溶液 10 l, 注入高效液相色谱仪，按照“”项下的条件，测量 3 种皂苷的峰面积。按“”项下的回归方程计算 3 种皂苷及它们之和的平均质量分数。按照处方比例计算，人参和三七混合药材中三七皂苷 R1 的质量分数为%，人参皂苷 Rg1 和 Rb1 分别为%和%，3 种皂苷之和为%(见表 5)。超声提取法被认为是提取率最高的一种方法10。本试验用 10 倍于药材量的 70%乙醇提取 3 次，每次 2 h。提取物8 / 10中 3 种皂苷的质量分数之和为%(见表 4)，略高于超声提取法的皂苷含量，可认为人参和三七的皂苷成分基本提取完全。表 4 提取工艺的验证结果表 5 人参、三七药材中皂苷含量3 讨论本研究选用乙醇回流提取法，用正交实验优选提取工艺，以 10 倍于药材量的 70%乙醇水溶液回流提取 3 次，每次 2 h。标志性皂苷成分三七皂苷 R1，人参皂苷 Rg1 和Rb1 的质量分数为药材的%，为总皂苷的%，人参和三七的皂苷成分基本提取完全。所选工艺条件已应用于工业放大生产试验，效果良好。在验证实验中增加了第 4 次用水提取 1 h。用水作溶剂，有利于丙二酰基类皂苷的提取(人参皂苷Rb1，Rb1，Rb1，Re 等)11。但是，水溶性杂质增多，提取液难以过滤，浓缩费时。要不要用水提取第 4 次，取决于制剂工艺的需要：如果提取规模小，或者需要控制水溶性杂质和出膏率，无需用水提取第 4 次;如果大规模生产，人参和三七用量大，可以用水提取第 4 次，提取液浓缩后，调成弱碱性，使丙二酰基类皂苷脱去酰基，变成相应的人参皂苷，再用乙醇溶出皂苷，沉淀除去杂质，以便充分利用人参和三七贵重药材。9 / 10目前，已从人参中分离鉴定了 46 种单体人参皂苷12，三七含有总皂苷类成分，且大部分皂苷与人参皂苷类成分相同13。提取含人参和三七的中药复方药材，其评价指标常用标志性成分人参皂苷。当然，使用的人参皂苷和三七皂苷作为对照品的种类越多，分析结果的代表性会越强，分析成本也越高。本研究选用三七皂苷 R1，人参皂苷 Rg1 和 Rb1 为对照品，采用高效液相色谱法测定提取物中 3 种皂苷的含量，以 3 种皂苷含量的和作为评价指标，筛选正交实验的最佳工艺条件，具有较好的代表性，便于在生产中使用。8 郑 绯，徐 娟，梁 丹,等.正交试验法优选 F 胶囊中人参总皂苷的提取工艺J. 武警医学， XX,19(11): 995.9 于宗渊,黄