树舌多糖抑制胃癌mgc

1 / 7树舌多糖抑制胃癌 MGC作者：李荣辉，王玉，郑丽红，张春晶，许惠玉，张英博，潘洪明【摘要】 目的研究树舌多糖(Ganoderma applanatum polysaccharides,GAPS)粗提物对人胃粘液性腺癌 MGC-803 细胞增殖、细胞周期及其对受体蛋白酪氨酸激酶 EGFR 表达的影响，探讨树舌多糖抗肿瘤作用机制。方法 MTT 法检测不同时间不同浓度树舌多糖对胃癌细胞 MGC-803 增殖抑制作用;流式细胞仪检测 g/L 树舌多糖作用 72 h 后 MGC-803 细胞的周期分布，流式细胞仪检测和免疫荧光显微镜观察树舌多糖对 MGC-803 细胞 EGFR 表达的影响。结果树舌多糖对胃癌细胞 MGC-803 具有增殖抑制作用，并呈时间及浓度依赖性。 g/L 树舌多糖作用 72 h 后，MGC-803细胞被阻滞于 G0/G1 期，S 期和 G2/M 期细胞减少，与细胞对照组比较有差异，具有统计学意义(P 【关键词】 树舌多糖; MGC-803 细胞; 增殖; 细胞周期Abstract：ObjectiveTo study the effects of crude polysaccharide extracted from Ganoderma applanatum (GAPS) on proliferation, cell cycle and EGFR expression of human gastric cancer cell line MGC-803 and its possible mechanisms. MethodsMTT 2 / 7assay was used to investigate the inhibitory effect of GAPS on MGC-803 which was treated with different concentration of GAPS for 24 , 48 and 72 h. Cell cycle and expression of EGFR were analyzed by flow cytometry (FCM). The fluorescence intensity of EGFR expression in MGC-803 cells was observed by fluorescence microscope. ResultsGAPS inhibited the proliferation of MGC-803 cells in dose-dependent and time-dependent manners. After MGC-803 cells were treated with g/L GAPS for 72 h, cell cycle was arrested at G0/G1 phase with statistic significance of difference compared with control group (P Key words： GAPS; MGC-803 cell ; Proliferation; Cell cycle树舌 Ganoderma applanatum 又称“老牛肝” “扁芝”或“扁木灵芝” ，是一种大型担子菌，灵芝科植物树舌灵芝的干燥子实体。我国大部分地区均有分布，生长在阔叶树树干上或根部，其性平，味微苦，具有清热、止痛、化积、止血、化痰、抗癌等功效。国内学者对树舌多糖抗肿瘤作用的实验研究，从增加宿主免疫功能到对肿瘤细胞的直接作用、对癌基因,抑癌基因的调控以及对蛋白质组表达的影响等研究17。本实验通过树舌多糖作用于体外培养胃3 / 7癌细胞 MGC-803，观察其对胃癌细胞增殖和 EGFR 表达的影响及探讨机制。 1 材料与仪器细胞株胃癌 MGC-803 细胞购于中国科学院上海生命科学研究院,细胞以 1105/ml 接种于培养瓶中，加入含有10%灭活的胎牛血清、100 IU/ml 青霉素、100 g/ml 链霉素的 RPMI-1640 完全培养液，置于 37恒温，5%CO2 及饱和湿度的培养箱中培养，细胞贴壁生长，每 23 d 传代 1次。当细胞长到 80%时传代，用%胰蛋白酶消化，弃去胰酶，加入新鲜培养基吹打均匀，按 13 传代。药物树舌多糖(含量 30%)购于哈尔滨乐泰药业有限公司岔林河中药提取厂。按照文献8醇沉和去蛋白得到实验所用的树舌粗多糖。PBS 溶解配成浓度为 40 g/L 原液，微孔滤膜滤过除菌，4冰箱保存，用时将完全培养基稀释到所需浓度。试剂 RPMI-1640 培养基为美国 Gibco 公司产品;标准胎牛血清为天津灏洋生物制品科技有限责任公司产品;DMSO、MTT 为美国 Amresco 公司产品;细胞周期染色溶液为北京联科公司产品;FITC-EGF Receptor 为美国 BD 产品。仪器酶联免疫检测仪(5082 型)奥地利 TECAN 公司;流式细胞仪(FACS Calibur)美国 BD 公司;荧光显微镜为日4 / 7本 Olympus2 方法树舌多糖对胃癌细胞增殖的影响取对数生长期细胞离心后,调整细胞浓度为 5104 个/ml，200 l/孔接种于96 孔培养板中，共加 3 块板，培养 24 h。实验设空白组(完全培养基)、细胞对照组和多糖处理组(终浓度为， ， ， ， g/L)。分别培养 24，48，72 h。实验终止前 4 h 加 5 mg/ml MTT 20 l/孔，4 h 后弃上清液。每孔再加入 DMSO 150 l，振荡器充分振荡 10 min 后，以空白组调零，在酶联免疫检测仪波长 570 nm 处，测定各组吸光度值(OD 值)并计算增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(1-用药组平均 OD值/对照组平均 OD 值)100%。实验重复 3 次。树舌多糖对细胞周期分布的影响 培养 72 h 后，收集细胞无水乙醇中固定 10 min，避光孵育 30 min,流式细胞仪上机检测细胞周期，实验重复 3 次。树舌多糖对 EGFR 表达影响流式细胞仪检测 EGFR 表达培养 72 h 后，收集细胞，2%多聚甲醛 2 ml 37固定 10 min,孵育 30 min。洗涤细胞，封闭 10 min，加 10 l 抗体，室温避光 30 min，去上清，加 ml PBS 重悬细胞，流式细胞仪上机检测，实验重复 3 次。荧光显微镜观察 EGFR 的表达把处于对数生长期的5 / 7细胞培养 24 h。按细胞对照组和树舌多糖组，分别加入完全培养基和 g/L 树舌多糖，培养 72 h。PBS 冲洗，加入无水乙醇，固定 20 min，封闭 30 min。按 150 稀释抗体，孵育 1 h，荧光显微镜下观察，照相。统计学分析统计软件进行统计学处理，采用 t 检验，所有数据以 s 表示，P 3 结果树舌多糖对 MGC-803 细胞增殖抑制作用 MTT 检测结果显示树舌多糖抑制 MGC-803 细胞的增殖，并呈时间和剂量依赖性，即随着药物浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制作用明显加强。 g/L 树舌多糖作用 72 h 后对MGC-803 抑制率为%。结果见图 1。图 1 树舌多糖对 MGC-803 细胞增殖抑制曲线树舌多糖对细胞周期分布的影响 MGC-803 细胞在 g/L 树舌多糖作用 72 h 后，收集细胞上流式细胞仪并检测分析细胞周期分布，经 ModFit LT for 软件分析结果：树舌多糖使 MGC-803 细胞的 G0/G1 期细胞比例有所增加，而S、G2/M 期细胞比例下降，差异有统计学意义(P 树舌多糖对 MGC-803 细胞 EGFR 表达的影响 g/L 树舌多糖作用72 h 后，荧光显微镜及流式细胞仪结果显示树舌多糖组荧光强度较细胞对照组明显减弱，即 EGFR 表达减少。结果见图 34。6 / 74 讨论MTT 法检测树舌多糖对人胃癌 MGC-803 细胞增殖抑制作用，根据绘制细胞增殖抑制曲线来看树舌多糖可抑制MGC-803 细胞生长且具有明显的时效和量效关系，即浓度越大，作用时间越长，抑制作用也就越强。 g/L 树舌多糖作用 72 h 后对 MGC-803 抑制率为%。根据以上实验结果采用其中一个作用点，72 ， g/L 树舌多糖作为本实验的作用时间和浓度。肿瘤是一类渐进性细胞周期调控机理破坏的疾病9。应用流式细胞仪检测 MGC-803 细胞周期分布结果显示，树舌多糖组 G0/G1 期、S 期、G2/M 期比例有所增加，S 期、G2/M 期细胞比例减少，表明树舌多糖抑制 MGC-803 细胞增殖主要是通过阻止肿瘤细胞由 G1 期进入 S 期，防止其损伤的碱基被复制;使进入 S 和 G2/M 期细胞减少，延缓细胞周期进程，使细胞的增殖速递减慢，抑制肿瘤细胞的增殖。表皮生长因子受体( EGFR)是常见的受体型蛋白酪氨酸激酶(PTK)，PTK 的异常活化也可能激活 Ras 信号通路。EGFR 基因在许多上皮来源的肿瘤组织中呈现表达或有过表达的改变10，11。有研究表明12，EGFR 在胃癌组织中的阳性表达率较高，与胃癌的浸润、转移及预后密切相关。本实验对 EGFR 的表达进行检测，实验结果显示树舌多糖可以使 MGC-803 细胞对 EGFR 的表达水平降低，用两种不同的7 /