激光显微镜

激光扫描共聚焦显微镜,目录CONTENT,PART ONE,PART TWO,PART THREE,PART FOUR,PART FIVE,PART SIX,背景,特点,结构,原理,优势,应用,PART ONE,背景,PART ONE 选题背景,LSCM,激光扫描共聚焦显微镜,激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope）是20世纪80年代中期发展起来并得到广泛应用的新技术，它是光学显微镜与现代激光技术，高灵敏探测技术，扫描控制技术以及微机图象处理技术，荧光及标记技术相结合产生的先进的细胞分子生物学分析仪器。主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。共聚焦激光扫描显微（英文Confocal laser scanning microscopy，CLSM，LCSM）是一项高分辨率三维光学成像技术。,PART TWO,特点,PART TWO 特点,1、光学分层能力,其光学分层能力，即获得特定深度下焦点内的图像。图像通过逐点采集，以及之后的计算机重构而成。因此它可以重建拓扑结构复杂的物体。对于不透明样品，可以进行表面作图，而对于透明样品，则可以进行内部结构成像。,2、内部结构成像,内部结构成像上，图像质量在单台显微镜中就可以得到极大的提升，因为来自样品不同深度的信息未被重叠。,其主要特点是可以对样品进行断层扫描和成像，进行无损伤观察和分析细胞的三维空间结构。,PART THREE,结构,PART THREE 结构,激光扫描共聚焦显微镜用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。,在结构配置上，激光扫描共聚焦显微镜除了包括普通光学显微镜的基本构造外，还包括激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统 (包括数据采集、处理、转换、应用软件)、图像输出设备、光学装置和共聚焦系统等部分。,PART THREE 结构,照明针孔,使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。且与探测器针孔及焦平面形成共聚焦装置。,物镜,探测器针孔,起到空间滤波器的作用。最大限度的阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息（两点共轭）。,光电倍增管（探测器）,接受通过针孔的光信号，转变为电信号传输至计算机，在屏幕上出现清晰的整幅焦平面的图象。,激光器,可以根据研究究需要选择不同的激光器。,一个完整的LSCM系统由几个主要的硬件和一些成像分析软件组成。硬件包括表面荧光显微镜、激光光源及冷却系统、定位扫描装置、分辨系统、计算机控制系统、显示器和图像输出打印设备，软件由三维图像分析系统和三维图像文件管理系统构成。,PART FOUR,原理,工作原理：在传统光学显微镜基础上，激光扫描共聚焦显微镜用激光作为光源，采用共轭聚焦原理和装置，传统显微镜能“看”到所有能被光投身到地方，而对于共聚焦显微镜，只有焦点处的信息被采集。实际上共聚焦激光扫描显微是通过对焦点深度的控制和高度限制来实现的。并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理观察、分析和输出。激光共聚焦扫描显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。 组织样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管（PMT）探测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示器上显示图像。,在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。 以激光作光源并对样品进行扫描，在此过程中两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜。,PART FOUR 原理,PART FIVE,优势,PART FIVE 优势,LSCM除具有成像功能外，还有图象处理功能和细胞生物学功能，前者包括光学切片、三维图象重建、细胞物理和生物学测定、荧光定量、定位分析以及离子的实时定量测定；后者包括黏附细胞的分选、激光细胞纤维外科及光陷阱技术、荧光漂白后恢复技术等。由于该仪器具有高分辨率、高灵敏度，因而为基础医学与临床医学的研究提供了有效手段。此外，CLSM 对荧光样品的观察具有明显的优势，只要能用荧光探针进行标记的样品就可用其观察。,PART FIVE 优势,图像处理,LSCM的图象是以电信号的形式记录下来的，所以可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行图象处理,三维定位,LSCM利用共聚焦系统有效的排除了焦点以外的光信号干扰，提高了分辨率，显著改善了视野的广度和深度，使无损伤的光学切片成为可能，达到了三维空间定位,捕捉信号,由于LSCM能随时采集和记录检测信号，为生命科学开拓了一条观察活细胞结构及特定分子、离子生物学变化的新途径。,PART SIX,应用,PART SIX 应用,在生物及医学等领域的应用越来越广泛， CLSM为生命科学开拓了一条观察生命活细胞的结构及特定分子、离子生物学变化的新途径，利用免疫荧光标记和离子荧光标记探针，该技术不仅可观察固定的细胞、组织切片,还可以对活细胞的结构、分子、离子及生命活动进行实时动态观察和检测，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+，pH 值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具，极大地丰富了人们对细胞生命现象的认识。共聚焦及双光子在现代生物学研究中有如下应用：,PART SIX 应用,组织和细胞中的定量荧光测定细胞间通讯的研究；细胞物理化学测定,多色荧光成像，具有多磁道和双向扫描，曲线扫描等特性荧光原位杂交；荧光漂白恢复；荧光共振能量转移；光生命期成像显微术；荧光相关光谱,实时成像，可进行活细胞跟踪三维重构及定量分析。细胞内钙离子和pH值动态分析。离子成像/比率成像，可进行Ca2+,Mg2+,H+,Na+,K+,Zn2+,Ni2+,Fe2+,Hg2+,Pb2+及Cd2+等成像,PART SIX 应用,1,2,3,4,5,6,THE END,主要结论,THE END 主要结论,结论,优点,激光扫描共聚焦显微镜是近80年代以来发展起来的高科技医学图像分析仪器，与传统的荧光显微镜相比，分辨率有了进一步提高，最重要的是清晰度大为提高。,缺点,LSCM也存在一些不足，比如激光管有使用寿命的限制；检测过程中需要使用荧光染料，增加了检测成本；激光存在荧光漂白作用及细胞毒性，应在使用过程中加以关注。,前景,激光扫描共聚焦显微镜的发明是对电子显微镜的一个补充，在生物学尤其是细胞生物学领域有着广阔的应用前景。