祖师麻注射液的高效液相指纹图谱研究

1 / 6祖师麻注射液的高效液相指纹图谱研究作者：刘妍，王胜利，毕慧敏，游富英，孙秀欣【摘要】目的建立祖师麻注射液 HPLC 指纹图谱，为中成药产品及生产工艺过程质量控制提供有效方法。方法色谱柱为 VP ODS C18( mm150 mm，5 m)，柱温为 30，流速为 ml/min，检测波长为 326 nm，以乙腈和%的醋酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。结果祖师麻注射液有 8 个共有峰，相似度96%。结论该方法简便可靠，可有效用于祖师麻注射液生产过程中的质量控制和对产品的质量评价。 【关键词】 祖师麻注射液；高效液相色谱；指纹图谱中药质量控制技术是中药现代化的关键技术之一，HPLC 指纹图谱技术正在越来越多地应用于中药质量控制1，2 。祖师麻为瑞香科(Thymelaeaceae)瑞香属植物黄瑞香(Daphne giraldii Nitsche)的根皮和茎皮，药理研究表明祖师麻具有较强的镇痛、抗炎、抑菌等药理活性，在临床上多用于风湿病痛的治疗，疗效显著。祖师麻含有香豆素类、二萜类、木质素类、黄酮类、蒽醌类及甾醇类等化学成分，其中祖师麻甲素又称瑞香素，为生理活性成分3 。目前主要是通过祖师麻甲素含量的测定确定祖师麻注射液的质量4，5 ，关于祖师麻注射液各种指纹图谱技2 / 6术研究未见报道。本实验对祖师麻注射液进行了 HPLC 指纹图谱研究，为祖师麻注射液内在质量的评价提供依据。1 仪器与试剂岛津 LC-2016A 高效液相色谱仪，色谱柱：VP ODS C18( mm150 mm，5 m)。乙腈为色谱纯，水为双蒸水，对照品祖师麻甲素，购于中国药品生物制剂鉴定所，其他试剂均为分析纯。2 方法与结果对照品溶液的的制备精确称取 4 mg 祖师麻甲素对照品于 10 ml 的容量瓶中，加甲醇溶解并定容制成质量浓度为 mgml-1 的祖师麻甲素对照品溶液。祖师麻注射液样品的来源和处理祖师麻注射液由山西万荣三九药业有限公司，批号分别为 0710162， 0711171， 0801071，0801072 ，0801281， 0801311， 0802071，0804191， 0902083 ，0902103。取注射液样品适量，用 m 微孔滤膜过滤，作为供试品直接进样。色谱条件色谱柱为 VP ODS C18(150 mm mm，5 m)；体积流量 mlmin-1 ；柱温 30，检测波长 326 nm；进样量10 l；流动相为乙腈%醋酸水溶液梯度洗脱；条件见表1。表 1 祖师麻注射液 HPLC 指纹图谱梯度洗脱表方法学考察3 / 6精密度实验取同一批号供试品在上述色谱条件和测定方法下，连续进样 5 次，结果表明 5 次测定图谱中 8 个共有峰保留时间的 RSD 为 ，峰面积的 RSD 为。指纹图谱中各共有峰相对保留时间和峰面积基本一致，其相似度均大于 99%，证明仪器精密度良好。重复性实验取同一批号供试品 5 份，分别用 m 的滤膜过滤测定，结果 8 个共有峰保留时间和峰面积的 RSD 分别为和，5 个样品色谱图相似度大于 99%，该方法重复性良好，稳定可靠。稳定性实验同一批号供试品，分别在 0，2，5，8，12，16 h 进样检测，色谱图中 8 个共有峰保留时间和峰面积的 RSD 分别为 和 ，6 次分析所得色谱图相似度大于99%，证明样品在 16 h 内稳定。指纹图谱的测定及相似度计算 按照选定的色谱条件对 10 个批次的祖师麻注射液成品进行指纹图谱检测，记录色谱图并积分，图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统 XXA 版，截取 045 min 的色谱图，按平均值法生成对照图谱，进行相似度计算，确4 / 6定得到 8 个共有峰，见图 1。各共有峰的保留时间和峰面积见表 2，相似度见表 3。8 个共有峰的峰面积之和占总峰面积的 90%以上，保留时间的 RSD 为，相似度96%，符合指纹图谱研究技术的要求。按表 1 梯度色谱条件对祖师麻甲素对照品溶液进行测定，由保留时间得到 3 号峰为祖师麻注射液中有效成分祖师麻甲素特征峰。3 讨论流动相的选择本实验先采用了等度洗脱，发现用强洗脱能力的流动相时，出峰时间很早，且峰不能很好的分开，再用弱洗脱能力的流动相时，出峰少，且出峰时间太迟，故采用梯度洗脱。分别使用了乙腈-水，乙腈-磷酸，乙腈-醋酸，甲醇-水，甲醇-磷酸，甲醇-醋酸作用流动相进行线性梯度洗脱，用洗脱能力较强的乙腈时峰的分离情况较甲醇好，色谱峰窄，柱压低。在水相中加入磷酸或醋酸后，出峰明显增多，峰有较大的改善，而用醋酸时的基线较磷酸时平直，综合考虑，选用乙腈-醋酸作为本实验的流动相梯度洗脱。表 2 10 批祖师麻注射液 HPLC 指纹图谱共有峰保留时间和峰面积测定结果表 3 10 批祖师麻注射液 HPLC指纹图谱相似度测定结果检测波长的选择比较了254，285，305，315，326，330 nm 时的色谱图，波长为5 / 6326 nm 时的色谱图最为理想，其它波长下在 50 min 后基线均有不同程度的飘移。柱温的选择比较柱温为 25，28，30，35时的色谱图，柱温在 30以下时，个别成分峰吸收降低，分离度下降，在 35以上时出峰时间提前，故本实验选择柱温为30。分析确定的色谱条件下生成的液相色谱图可见，此条件下色谱峰数目最多，分离度较理想，注射液主要成分即祖师麻甲素主峰突出；方法学考察显示本实验方法稳定、可靠，对评价祖师麻注射液的内在质量有一定的实用价值。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以 10 批祖师麻注射液的指纹图谱综合平均作为对照模板，计算 10 批样品共有峰的相似度，均大于 96%，说明不同时间生产的祖师麻注射液质量稳定。但从指纹图谱中还可以看出，虽然都出现了相应的成分峰，但是峰面积比值不尽相同，说明不同批号的注射液在含量上存在明显差异，原因可能为所使用的原料