质粒的提取及鉴定.ppt

实验六质粒DNA的少量提取及鉴定 天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系辛灵彪 目的要求了解质粒的概念 熟悉提取质粒的基本原理 掌握碱变性法提取质粒DNA的方法 a 什么是质粒 plasmid b 质粒的本质是什么 c 质粒有哪些构型 c 质粒有哪些特点 d 质粒的用途有哪些 3 1 关于质粒的概念 质粒的定义质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子 能稳定地独立于染色体外 并传递到子代 一般不整合到宿主染色体上 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在 4 超螺旋DNA supercoiledDNA SCDNA 线状DNA linearDNA LDNA 如果两条链均断开 即为线状DNA 3 开环DNA opencircularDNA OCDNA 如果两条链中有一条的一处或多处断裂 分子就能发生旋转而消除链的张力 形成松弛型的环状分子 质粒的三种构型 5 质粒DNA的一般特性 1 宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多 2 它是双链闭合环状DNA 分子量大小不等 3 质粒是细菌内的共生型遗传因子 有相对独立性 4 它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型 菌毛 抗药性等 分离纯化质粒DNA的主要步骤 1 培养细菌使质粒扩增 DNA的扩增与选择 2 细菌的收集与裂解收集方法 高速离心的方法裂解细菌方法 去污剂法 有机溶剂法 碱变性法 沸水热裂法 溶菌酶法 超声处理法等 根据质粒的大小 宿主菌菌株及裂解后的纯化方法等因素综合后加以选择 3 质粒DNA的纯化常用的方法有 超速离心 层析法 聚乙二醇沉淀法等所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状的性质 2提取大肠杆菌质粒DNA的方法和原则 原理示意图 实验原理 高碱 细菌的细胞壁破裂 内容物释放 染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA 线性双链DNA片段中的氢键断裂 双链解离变性 质粒DNA不发生断裂 保持双链闭合环状 双链DNA并不完全分离 纯化 RNA酶消化除去RNA 并用除去残留的蛋白质 试剂盒主要试剂及作用 溶液 由葡萄糖 EDTA Tris HCl组成 保护 缓冲 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度 减少抽提过程中的机械剪切作用 防止破坏质粒 保护作用 EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子 防止DNA酶对质粒分子的降解作用 保护作用 Tris HCl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围 缓冲作用 10 溶液II 由SDS 十二烷基硫酸钠 与NaOH组成 裂解 变性 SDS是离子型表面活性剂 其主要作用是 溶解细胞膜上的脂质与蛋白 从而破坏细胞膜 解聚细胞中的核蛋白 使蛋白质变性而沉淀下来 SDS能抑制核糖核酸酶的作用 所以在接下来的提取过程必须把它去除干净 以便后续更好地进行 NaOH PH 12 的作用是破坏氢键 使DNA分子变性 DNA变性作用 可瞬间溶解细胞及细菌 11 试剂盒主要试剂及作用 溶液III pH4 8KAC 乙酸钾 高盐溶液 pH调至中性 复性 分离 中和溶液 的碱性 使染色体DNA变性而发生缠绕 并使质粒DNA复性 KAC会与SDS形成溶解度很低的盐 并与蛋白质形成沉淀而除去 溶液中的DNA也会与蛋白质 SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离 试剂盒主要试剂及作用 吸附株纯化质粒DNA 实验步骤 1 收集4 5ml菌液于EP管 每次12000g 30s2 弃上清 加含RnaseA溶液I250 l 剧烈振荡3 加250 l溶液II 快速颠倒数次4 加350 l溶液III 温和振荡10s 12000g 10min5 转移500 l上清到吸附株 12000g 1min6 吸附柱中加700 l漂洗液 12000g 1min 弃废液 将吸附柱放入收集管中 7 向吸附柱中加入500 l漂洗液 12000g 1min 弃废液 将吸附柱放入收集管中 12000g 2min 8 将吸附柱敞口置于室温放置2min 挥发残余的乙醇 9 将吸附柱放入一个干净的EP管中 向吸附膜中央悬空滴加50 l经65 水浴预热的洗脱液 室温放置2min 12000g 1min 10 将此质粒DNA溶液置于 20 保存 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质 不带电荷 琼脂糖透明无紫外吸收 因此 目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳 在碱性环境下 DNA的磷酸基团解离 使DNA带负电荷 在电场中向正极方向泳动 因各种DNA分子的电荷数 分子量 构象不同 在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同 所以泳动的速度有差异 以此达到分离的目的 15 3 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定 实验材料及试剂 6xloadingbuffer 主要成分甘油 电泳指示剂和tris 甘油主要负责沉降DNA 避免飞样 指示剂肉眼可见 确定电泳状态 一般指示剂两种 溴酚蓝呈蓝紫色 甲苯晴呈蓝色 溴化乙锭 EB 荧光染料 可与DNA结合 在紫外光照射下呈红橙色荧光 有致癌性 TBE Tris Boricacid EDTA 核酸电泳的经典缓冲液 琼脂糖 用1xTBE配置琼脂糖凝胶 DNAmarker DNAMarker 是分子量不同的DNA片段 主要用途就是DNA分子凝胶电泳时 加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题 以及粗略判断样品的分子量 DNAMarker应选择在目标片段大小附近ladder较密集的marker 这样对目标片段大小的估计较准确 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素 1DNA分子的大小2构象3凝胶浓度4电压5缓冲液 质粒电泳图谱 实验步骤 移液器的使用 将微量液体从一个容器转移到另一个容器的计量器具 我们称之为移液器 移液器的使用 移液循环安装枪头设定容量吸液放液卸去枪头 移液器的使用 安装枪头 移液器的使用 原点第一停点第二停点 勿在液体中按至第一停点 枪头勿伸入液面太深 管壁加入 排尽液体 复位后 卸去枪头 移液器的使用 卸去枪头 无需用手接触枪头 1 加样枪正确使用 2 标记自己所提取的质粒类型 3 废液倒在水池中 枪头扔到垃圾桶中 4 加不同溶液要换枪头 5 离心前把管擦干 6 转移上清时不要吸到沉淀 7 使用前请先检查溶液 和溶液 是否出现混浊 8 溶液 溶液 和漂洗液使用后应立即拧紧盖子 9 洗脱液不少于50 l 20 保存 以防DNA降解 质粒提取注意事项 1 凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定 所以电泳前应对DNA片段大小有粗略估计 2 加EB时 胶的温度不要太高 高温会导致EB挥发 EB有致癌性 倒胶时避免产生气泡 3 缓冲液要完全没过点样孔 点样孔不能有气泡 4 紫外线照射不要太久 尤其避免直接照射皮肤 琼脂糖电泳注意事项 质粒的定义质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子 能稳定地独立于染色体外 并传递到子代 一般不整合到宿主染色体上 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在 28 基因克隆示意图 分 切 接 转 筛 实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称为重组DNA技术 又称基因工程 2BamHI Hind 酶切质粒及鉴定 2 1实验原理 利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的核苷酸序列 并切割DNA 产生一定长度的DNA片段 通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因 重组质粒DNA 33 实验七质粒DNA质粒DNA的浓度测定与双酶切鉴定 天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系辛灵彪 1 熟悉DNA的浓度测定方法 2 了解限制性核酸内切酶在基因工程中的应用 3 熟悉利用限制性核酸内切酶切割质粒的方法 目的要求 实验原理 1 质粒DNA浓度测定 1 DNA或RNA的定量OD260 1 0相当于50 g ml双链DNA40 g ml单链DNA 或RNA 20 g ml寡核苷酸2 判断核酸样品的纯度DNA纯品 OD260 OD280 1 8RNA纯品 OD260 OD280 2 0 OD260的应用 DNA样品的浓度 g l OD260 稀释倍数 50 1000OD260 OD280 1 7 1 9 打开紫外分光光度计 设定波长260nm 切换至紫外 1 质粒DNA浓度测定方法 200倍稀释样品 10 l质粒加水稀释至2000 l 洗净比色皿 加入待测样品 记录260nm的OD值 设定波长280nm 记录OD值 计算样品浓度和纯度 限制性核酸内切酶定义 能在特异位点 酶切位点 上催化双链DNA分子的断裂 产生相应的限制性DNA片段 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱 具有重大应用价值 分子手术刀 主要存在于细菌体内 39 2 质粒DNA双酶切鉴定 第一个字母取自产生该酶的细菌属名 用大写 第二 第三个字母是该细菌的种名 用小写 第四个字母代表株 用罗马数字表示发现的先后次序 限制性核酸内切酶命名 Hind Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶 限制性核酸内切酶的切割方式 1 20 l酶切体系 取两支1 5ml的Ep管 标号 按下表加入试剂 2 加样后 小心混匀 置于37 水浴中 酶解15min 3 终止酶解反应 80 反应5min 4 琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果 实验步骤 实验步骤 质粒酶切电泳图谱 酶切反应中应注意以下几个问题 1 内切酶 不应混有其他杂蛋白特别是其他内切酶或外切酶的污染 注意内切