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发酵谷氨酰胺研究 汇报人 陈超生物工程1501 课程论文 CONTENS 目录 谷氨酰胺的介绍 01 谷氨酰胺 学名2 氨基 4 氨甲酰基丁酸 英文Glutamine Gln 是谷氨酸的酰胺 L 谷氨酰胺是蛋白质合成中的编码氨基酸 哺乳动物非必需氨基酸 在体内可以由葡萄糖转变而来 符号 Q 谷氨酰胺可用于治疗胃及十二指肠溃疡 胃炎及胃酸过多 也用于改善脑功能 密封通风处保存 白色结晶或晶性粉末 能溶于水 不溶于甲醇 乙醇 醚 苯 丙酮 氯仿和乙酸乙酯 无臭 稍有甜味 在中性溶液中不稳定 在醇 碱或热水中易分解成谷氨醇或丙酯化为吡咯羧醇 无臭 有微甜味 谷氨酰胺 01 谷氨酰胺 01 谷氨酰胺是人类以及其他哺乳动物血浆中含量最丰富且重要的一种游离氨基酸 在生物体代谢中有着举足轻重的作用 由于谷氨酰胺重要的生理作用及其在营养学 生理学 免疫学等方面的重要价值 国内外都对其进行了深入研究 日本在1977年开始使用发酵法生产谷氨酰胺 发酵水平到20世纪90年代中期已经达到了60g L 但由于菌种的发酵性能差 发酵工艺不先进 产品提取率低等问题 所以很少用于实际应用 除此之外 谷氨酰胺也被认为是一种极有发展前途的新药 在细胞氮代谢中除了作为构成蛋白质的氨基酸参与蛋白质合成外 其酰胺氮又能作为氮源参与核酸和蛋白质的合成 同时在不同的组织中还具有不同的代谢作用 02 谷氨酰胺发酵方法 1961年 木下一干等首先发现谷氨酸发酵液中除谷氨酸外还有谷氨酰胺存在 1963年 木下祝郎在谷氨酸微球菌 Micrococcusglutamine 发酵液中也发现有谷氨酰胺存在 目前 生产谷氨酰胺的菌种主要包括谷氨酸棒杆菌 Cor Ttebacteriumglutamicum 北京棒杆菌 epekinense 乳糖发酵短杆菌 Brevibacteriumlactofermetbtum 黄色短杆菌 B flavun 里建思黄杆菌 Flavobacteriumrigebnse 和钝齿棒杆菌 ecrenatum 等 这些菌种又可分为2种 一种原为谷氨酸生产菌种 通过改变条件 由生产谷氨酸转向生产谷氨酰胺 另一种为谷氨酸产生菌的变异株 其中 谷氨酸产生菌变异株生产谷氨酰胺的方法较普遍 且诱变剂较易得到 目前常用此方法获得高产菌株 谷氨酰胺的发酵 谷氨酰胺高产菌株的诱变选育现在谷氨酰胺生产菌株主要是用传统的随机诱变结合定向筛选的方法选育 有化学诱变 物理诱变等 常用的诱变剂和诱变因子有硫酸二乙酯 亚硝基胍 紫外线等 定向筛选又有对氨基苯甲酸结构类似物磺胺胍的抗性突变筛选 Gln结构类似物抗性突变筛选 高铵根离子浓度抗性突变筛选 02 谷氨酰胺的发酵 现在报道的有 张柯旭等以天津短杆菌 B tianjinses T G 886 174为出发菌株 用亚硝基胍 硫酸二乙酯进行诱变 获得1株谷氨酰胺产生菌GW77 平均产L 谷氨酰胺21 4G L 最高产量可以达到33 2g L 王福源等以北京棒状杆菌 Cpekinense AS1 299为出发菌株进行诱变 得到1株谷氨酰胺产生菌AX 8 SG 其谷氨酰胺积累量为23g L 李爽通过黄色福杆菌经NTG诱变 筛选抗SG和DON的高产谷氨酰胺菌株B F64 最高产胺可达5 22 具有工业化开发价值 02 谷氨酰胺发酵方法 02 除此之外还有化学合成法生产谷氨酰胺 如下图 两种方法均可采用浓硫酸作为必需的催化剂 且要求催化剂Raney镍 但反应步骤多 收率低 并且化学试剂污染环境 谷氨酰胺发酵方法 酶法合成Gln 主要反应为上式 用NH3以及谷氨酸作为原料经过合成酶催化生生谷氨酰胺 但同时ATP是必需的 但ATP价格昂贵 很难在工业生产中使用 02 发酵条件 发酵条件的变更创造了有利于合成谷氨酰胺的环境 谷氨酸产生菌种的谷氨酰胺合成酶活力增加 谷氨酰胺合成酶活力受到抑制 谷氨酰胺大量积累生成 谷氨酸生成量减少 其次 细胞环境的影响下 谷氨酰胺从细胞中分泌出来积累在发酵液中 谷氨酸因为渗透性减小留在了细胞中 发酵转化也可以实现 03 发酵条件 L 谷氨酸条件影响增补CI 抑制L 谷氨酸流出高浓度NH4 刺激L 谷氨酸及N 乙酰谷氨酸的酰胺化低PH抑制酰胺的分解L 谷氨酰胺或N AGM刺激L 谷氨酰胺合成增补Zn2 酶的优先反应L 谷氨酰胺L 谷氨酸向L 谷氨酰胺发酵转换的机制 02 影响因素 1 铵根离子供给量 供给的铵根离子必须超过用来生产谷氨酸的铵根离子量 否则后阻碍菌体的生长2 CI 和SO42 使用二价硫酸根离子时副产物明显增多 谷氨酸和谷氨酰胺产量相当 而使用氯离子时谷氨酸产量仅为谷氨酰胺产量的16 67 3 发酵液的PH值 发酵全过程均处于微酸性环境 且发酵过程分为成长菌及产胺期 发酵液的PH值需要维持在7 2 24小时后发酵结束控制在6 2 4 金属离子 二价锰离子 二价镁离子 二价锌离子的供给均能提高谷氨酰胺的产量 03 谷氨酰胺营养 04 肠道的谷氨酰胺营养Newsholne指出 复制细胞的谷氨酰胺代谢最重要的途径是由a一酮戊二酸变为草酰乙酸 后者又转变为丙酮酸 由谷氨酰胺碳来源的丙酮酸很少经TCA氧化 尽管复制细胞所有的TCA酶活性都很高 高的谷氨酰胺利用率提供了最适条件以TCA循环调节细胞周期中嘧啶和嘌呤核苷酸的合成 谷氨酰胺利用率下降可能会降低细胞增殖率 增殖的小肠上皮细胞谷氨酰胺的利用率相当高时才能确保细胞分化和粘膜的细胞的更新 谷氨酰胺在维持小肠的代谢 结构和功能上起着重要的作用 Klimberg等研究表明为大鼠提供含谷氨酰胺的食品可增加空肠粘膜重和DNA含量 减少与常规静脉灌注相联系的缄毛萎缩 而且牯膜DNA的增加是显著的 发现谷氨酰胺与表皮生长因子具有协同作用 Grant的研究也表明供给谷氨酰胺的食品增加了绒毛高度和肠道氮含量 Salloum等证实饥饿后基础日粮掭加谷氨酰胺可加快粘膜的更新 谷氨酰胺营养 04 谷氨酰胺对胰腺和肝脏的营养作用Helson等证实了在肠内供应谷氨酰胺也支持胰脏生长及其它功能 它们研究了对60 切除小肠和未切除的大鼠富含谷氨酰胺的TNP 全静脉营养液 对胰脏外分泌腺的影响 发现在两种动物中 谷氨酰胺的掭加显著增加了胰脏重 DNA含量和蛋白重 也增加了总的胰腺胰蛋白酶原和脂酶含量 谷氨酰胺可产生使胰腺泡增生而非萎缩的有利影响 Li研究了富含谷氨酰胺的TNP对肝脏脂肪变性的影响 他们的研究集中在观察过量的碳水化合物能量造成的太鼠脂肪肝以及与此相联系的门脉胰岛素 胰高血糖素摩尔比的提高 他们的研究表明对高渗葡萄糖添加L一谷氨酰胺可防止脂肪肝的形成 可能是通过刺激胰高血糖分泌 从而降低了门脉胰岛索 胰高血糖比率 而增加肝脏脂类的输出 Helton也发现了在切除大部分小肠后富含谷氨酰胺的肠内基础日糖在减缓肝的增重和脂肪含量方面有益的影响 这些研究表明外源谷氨酰胺能调节胰腺的内分泌 五 谷氨酰胺的药理作用 谷氨酰胺与免疫功能 谷氨酰胺具有促进机体免疫功能的作用 现有资料表明谷氨酰胺不仅是淋巴细胞和巨噬细胞的重要能源物质 甚至可能是各种免疫细胞的主要能源物质B 这些细胞对谷氨酰胺的利用类似对糖的利用 在需要量上甚至超过了糖 未分化的淋巴细胞对谷氨酰胺的利用率也很高 生理浓度的谷氨酰胺能满足免疫细胞的需要 但机体谷氨酰胺的含量不足会影响到这些细胞的功能 淋巴细胞对谷氨酰胺的利用率下降能影响它们的增殖率9 现认为谷氨酰胺影响免疫系统的原因可能是 谷氨酰胺是淋巴细胞嘧啶和嘌呤核苷酸合成的前体物 是合成核酸的不可缺少的氮源 谷氮酰胺在维持肠道免疫功能上起重要作用 肠是最大的免疫器官 是机体免疫的重要组成部分 谷氨酰胺是肠相关淋巴组织 GALT 的重要营养素 当机体受严重感染时 肠淋巴系统对谷氨酰胺的消耗大大增加 说明感染时 肠淋巴系统代谢增强 对谷氨酰胺利用增高 同时 动物实验证实谷氨酰胺是维持GALT和s l合成 防止细菌肠道移位的重要氨基酸 五 谷氨酰胺的药理作用 谷氨酰胺与严重手术 创伤 严重手术 创伤时 机体组织及血中游离氨基酸谱发生变化 其中最明显的变化是血循环和肌肉内谷氨酰胺浓度显著下降 虽然在手术 创伤等应激状态下 糖皮质激素分秘增多 促进了骨骼肌 肝 肺等器官释放出大量的谷氨酰胺 而且胃肠道对谷氨酰胺吸收增加近二倍 但血中谷氨酰胺浓度仍明显下降 提示其它器官在大量利用谷氯酰胺 事实上正是如此 骨骼肌 肝脏 肺脏等内脏器官释放出的谷氨酰胺转移到肠 肾 伤口处 被肠上皮细胞 淋巴细胞 巨噬细胞等增生细胞作为能量所利用 为伤口处成纤维细胞提供能量 促进伤口愈合 提高了机体对应激的适应能力 临床上患者由于术后进食量减少 不能从膳食中补充手术应澈时造成的谷氨酰胺过度消耗 最终不能满足伤口及小肠等对谷氨酰胺的需求 而影响机体的蛋白质合成能力 导致伤口愈合减慢 肠壁萎缩 因此在严重刨伤时提供外源谷氨酰胺 能起到节氮和减轻肠粘膜萎缩的作用 能促进机体的恢复 五 谷氨酰胺的药理作用 除此之外 谷氨酰胺也