血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳

血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,三峡大学生化实验学生小组,1.电泳 是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。 在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离2. 迁移率：单位电场强度时粒子运动的速度，以表示=u/E=Q/6r（Q为粒子所带电荷，E为电场强度，粒子运动速度为u,粒子半径r，介质粘度） 由此可知，粒子迁移率在一定条件下取决于粒子本身的性质，即其所带电荷多少，大小与形状,电泳,影响电泳分离效果的因素,根据支持介质的种类：醋酸纤维素薄膜电泳，琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰氨凝胶电泳等根据装置差异：薄膜电泳，垂直电泳，平板电泳，垂直圆盘电泳和毛细管电泳等,电泳分类,常用电泳技术,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,等电聚焦电泳,双向电泳,（一）蛋白质染色：1.氨基黑10B 是蓝黑色酸性染料，可与蛋白质结合形成青色结合物2.CBBR-2503.银染(二)核酸染色1.溴化乙锭2.SYBR荧光染料,经电泳分离的各种生物分子，需染色使其在支持介质上显示出相应的谱带，从而检验其纯度，含量及生物活性等。,实验目的,本实验是以醋酸纤维素薄膜作为支持体的区带电泳。 方法是将少量新鲜血清用点样器点在浸有缓冲液的乙酸纤维素薄膜上，薄膜两端经过滤纸与电泳槽中缓冲液相连，所用缓冲液pH值为8.6，血清蛋白质在此缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。 由于血清中不同蛋白质带有的电荷数量及分子量不同而泳动速度不同。带电荷多及分子量小者泳动速度快；带电荷少及分子量大者泳动速度慢，从而彼此分离。 电泳后，将薄膜取出，经染色和漂洗，薄膜上显示出五条蓝色区带，每条带代表一种蛋白质，按泳动快慢顺序，各区带分别为清蛋白、1-球蛋白、 2-球蛋白、 -球蛋白和-球蛋白。 经洗脱比色观察不同蛋白质的区带。,实验原理,人血浆蛋白的等电点，相对分子质量,电泳槽，电泳仪，脱色摇床，染缸，滤纸，醋酸纤维素薄膜实验试剂1. 4x电极缓冲液 取1mol/L Hcl 24.0ml与Tris18.2g加蒸馏水溶解，调至pH 8.6,然后定容至100ml,临用前稀释4倍即为电极缓冲液工作液。2.氨基黑染色液 称取氨基黑10B 0.1g,溶于无水乙醇20ml中，加冰醋酸5ml，甘油0.5ml,溶解，然后将磺柳酸2.5g溶于少量蒸馏水中，加入前液，再以蒸馏水补足体积至100ml。3.漂洗液 甲醇45 ml,冰醋酸5ml和蒸馏水50ml,混匀。适用于氨基黑10B 染液的漂洗,实验器材,1，准备2，浸膜3，点样4，平衡5，电泳6，染色7，定量,实验操作,准备：将电极缓冲液加入电泳槽的电极室内并使两极室液面等高，调节电泳支架宽度正好适合醋酸纤维素薄膜的长度。用4层纱布或滤纸做盐桥，一端浸入缓冲液中，一端搭在支架上.,具体步骤,浸膜：在膜条无光泽面距一端1.5cm处用铅笔轻划点样线，浸入电极缓冲液中，至完全浸透为止（=20min）。用镊子取出薄膜，点样线向上平放于干净滤纸上，用滤纸轻轻地按压，吸去薄膜上多余的液体。点样：取少量待测血清均匀涂抹在玻璃片上，用宽1cm的平整塑料软片末端蘸取少许样品，垂直轻印到薄膜点样线上，形成一条细窄而均匀的直线。此步是实验的关键。以印章法加样时，点样量不宜过多，动作应轻、稳，用力不能太重。,具体步骤,平衡：将膜条无光泽面向下置于电泳槽支架上，点样端靠近负极。薄膜两端要紧贴滤纸，中间平直悬空，加盖密封，平衡5min.电泳:将电泳槽正、负极与电泳仪正、负极接好。开启电源，调节电流密度为0.5mA/cm或电压15V/cm。通电约50min后关闭电源。染色：取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中，染色510min。然后在漂洗液中漂去剩余染料，直至背景无色为止。回收漂洗液。,具体步骤,定量：将干燥的薄膜电泳图放入自动扫描光密度仪内，记录仪上自动绘出蛋白质组分曲线图。每一个峰代表一种蛋白质组分。若使用具有电子计算机附件的自动扫描光密度仪，可通过相关软件的分析，直接获得每条区带蛋白质的百分含量。,具体步骤,1.每次电泳时应交换电极，使两侧电泳槽内缓冲液的正、负离子相互交换，使缓冲液的pH维持在一定的水平。使用10次后，最好将缓冲液弃去。2.电泳槽两侧的缓冲液液面应保持在同一水平面上，否则，通过薄膜时会有虹吸现象，将会影响蛋白质分子的泳动速度。3.电泳失败的原因包括：（1）电泳图不整齐：由点样不均匀、薄膜未完全浸透、温度过高、缓冲液变质或薄膜放置不正确引起；（2）各组分分离效果不佳：由点样过多、电流过低、薄膜结构过分细密或透水性差等引起;(3)染色后蛋白区带中间着色浅：由于染色时间不足或染色液陈旧所致。,注意事项,肝硬化时，白蛋白显著降低，r球蛋白升高23倍；肾病综合征时，白蛋白降低，a2球蛋白和球蛋白升高。Figure4-3为正常人和几种典型异常血清蛋白电泳图谱及其扫描曲线。,1.在本实验的电泳过程中，正负极各发生什么反应?电极附近缓冲液pH有