实验七+人体外周血淋巴细胞培养

1 实验五实验五 人的外周血淋巴细胞培养人的外周血淋巴细胞培养 一 实验原理一 实验原理 外周血液中的小淋巴细胞 几乎都处在 G1 期 或 Go 期 一般情况下是不再分裂的 在培养液中加 入植物凝血素 PAH 时 这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞 随后进入有丝分裂 这样经过 短期培养 秋水仙素的处理 低渗和固定 就可获得大量的有丝分裂细胞 本方法已为临床医学 病毒 学 药理学 遗传毒理学等方面广泛应用 二 实验目的二 实验目的 掌握人体微量血液体外培养 制备染色体标本的方法 三 实验材料三 实验材料 人的外周血 四 实验器具和药品四 实验器具和药品 1 用具 用具 2 毫升灭菌注射器 离心管 吸管 试管架 量筒 培养瓶 试剂瓶 酒精灯 烧杯 载 玻片 切片盒 天平 离心机 恒温培养箱 显微镜 2 器皿的清洗和消毒 器皿的清洗和消毒 玻璃器皿在使用前 均应用肥皂水洗刷 清水冲净 烘干后浸泡在洗液中至少 2h 再用流水冲洗 烘干待消毒 将已洗净 烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装 放入干燥消毒箱内 150 1h 隔离衣 口罩 橡皮塞 注射用针筒等则用高温高压消毒 15 磅 15min 3 药品 药品 1 RPMI 1640 培养基 称取 1640 粉末 10 5 克 用 1000ml 的双蒸水溶解 如溶液出现混浊 或难以溶解时 可用干冰或 CO2气体处理 如 pH 值降至 6 0 时 则可溶解而透明 每 1000ml 溶液加 NaHCO 1 0 1 2g 以干冰或 CO2气体校正 pH 至 7 0 7 2 立即以 5 号或 6 号细菌漏斗过滤灭菌 分 装待用 2 肝素 作为抗凝剂使用 称取该粉末 160mg 每 mg 含 126U 用 40ml 的生理盐水溶解 此溶液 的浓度为每 ml 500U 高压消毒 8 磅 15min 3 秋水仙素 作为有丝分裂的阻止剂 它能改变细胞质的粘度 抑制细胞分裂时纺锤体形成 使 细胞分裂停留在中期 称取秋水仙素 4mg 用 100ml 生理盐水溶解 用 6 号细菌漏斗过滤 然后放入冰 箱 4 保存 使用时用 1ml 注射器吸取该溶液 0 05 0 1ml 加入 5ml 的培养物中 其最终浓度为 0 4 0 8ug ml 4 植物凝血素 PHA 是淋巴细胞有丝分裂刺激剂 提取 PHA 的方法有两种 一种比较简单 直 接用四季豆的浸出液 另一种较复杂 最后制品为粉末 如用之得当 二种方法均可获得良好的效果 盐水浸取法 最好用皮色四季豆 但其它颜色如红斑色 黑色 黄色 白色的四季豆亦可 取豆子 20g 用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物 先在水中浸过夜 4 次日倒去水分 将豆子放入组 织搅碎器内 加 30ml 生理盐水 开动搅碎器使之成为粘糊状 向搅碎器再加 70ml 生理盐水 混合均匀 置冰箱 24h 然后以 3000 转 min 离心 15min 取上清液 用生理盐水稀释 10 倍 5 号除菌滤斗过滤 2 分装小瓶 冰冻保存 酒精乙醚提取法 四季豆 50g 先用生理盐水洗净 将豆浸入 60ml 盐水中 保存于 4 冰箱内 24h 后用组织搅碎器将其磨成匀浆 再加 140ml 盐水 置 4 冰箱中 24h 取出后以 6000 转 min 离心 20min 吸取上清液 调 pH 至 5 6 用 0 1mol L HCl 调 之后 每 100ml 上清液加 40ml 无水酒精 加以 搅拌 以 3000 转 min 离心 15min 取上清液 弃去沉淀 在每 100ml 上清液中加 170ml10 乙醚无水 酒精 10ml 乙醚十 90ml 无水酒精 以 3000 转 min 离心 15min 取沉淀放入培养皿中 在含有硅胶的抽 气干燥器中抽气 2 4d 沉淀物逐渐变得干硬 将沉淀物研磨成粉末 以 0 85 NaCl 液配成 1 的溶液 此 PHA 溶液经细菌滤器过滤后分装在小瓶中 冰冻保存 使用时每 5ml 培养物加 0 1ml 即可 如果在 得到沉淀物后的干燥及研磨等过程中充分保持灭菌操作 那么配成的 PHA 溶液便无需用细菌滤器过滤 5 抗菌素 青霉素 以每瓶 40 万 U 为例 以 4ML 生理盐水 或培养基 稀释 则每 ML 含 10 万 U 取 1ml 加入 100ml 培养基中 则最终浓度为 100U ml 链霉素 以每瓶 50 万 U 为例 以 2ml 生理盐水 或培养基 稀释 则每 ml 含 25 万 U 取 0 4ml 含 10U 加入 1000ml 培养基中 则每 ml 含 100U 即 100 g 100 万 U lg lg 1 106 g 6 姬姆萨染液 0 5g 姬姆萨粉末 加 33ml 纯甘油 在研钵中研细 放在 56 恒温水浴锅中保温 90min 再加入 33ml 甲醇 充分搅拌 用滤纸过滤 收集在棕色细口瓶中保存 作为原液 用时以磷酸 缓冲液 pH7 4 1 10 稀释 7 0 1mol L 磷酸缓冲液 pH7 4 7 6 A Na2HPO4 12H20 28 8g KH2PO4 无水 2 67g 溶解于 1000ml 双蒸水中 B Na2HPO4 7H20 2 164g NaH2PO4 2H20 0 3g 溶解于 1000ml 双蒸水中 五 实验步骤五 实验步骤 1 培养液的分装 培养液的分装 在无菌室或接种罩内 用移液管将培养液和其它各试剂分装入培养瓶 每瓶量 为 培养液 RPMIl640 或 M199 4ml 小牛血清 lml PHA 0 2ml 肝素 0 05ml 双抗 青霉素加链霉素 培养液中最终浓度各为 100U ml 用 3 5 NaHCO3调 pH 到 7 2 7 4 分装到 20ml 的玻瓶中 用橡皮塞塞紧 待用或置于 0 条件下 保藏 用前从冰箱内取出 放入 37 恒温锅中温育 10min 2 采血 采血 用 2ml 灭菌注射器吸取肝素 500U ml 0 05ml 湿润管壁 用碘酒和酒精消毒皮肤 自肘 静脉采血约 0 3ml 在酒精灯火焰旁 自橡皮塞向培养瓶内 内含有生长培养基 5ml 接种 轻轻摇动几次 直立置 37 0 5 恒温箱内培养 3 培养 培养 置 37 温箱内培养 66 72h 4 秋水仙素处理 秋水仙素处理 培养终止前在培养物中加入浓度为 40 g ml 的秋水仙素 0 05 0 lml 最终浓 度为 0 4 0 8 g ml 置温箱中处理 2 4h 5 低渗处理 低渗处理 低渗液的种类较多 如 0 075mol L 的 KCl 溶液 0 95 的枸橼酸钠溶液 用蒸馏水 稀释 4 倍的 Hanks 液 也可直接用蒸馏水 秋水仙素处理完毕 小心地从温箱取出培养瓶 用滴管吸弃 上清液 培养物沉积在瓶底 然后加入温育的低渗液 5 毫升 用滴管轻轻冲打成细胞悬液 装入离心管 3 中置 37 温箱内处理 20min 使红细胞破碎 白细胞膨胀 6 离心 离心 以每 1000rpm min 离心 5min 弃去上清液 收集白细胞 7 固定 固定 固定液为甲醇 冰醋酸 3 1 每只离心管中 加入固定液 2 4ml 片刻后用滴管轻轻 冲打成细胞悬液 在室温中固定 15min 后 离心 吸弃上清液 留下白细胞 8 再固定 再固定 加入固定液 2ml 用吸管轻轻打散 室温下继续固定 15min 过夜也可以 9 再离心 再离心 除去上清液 留下白细胞制片 10 制片 制片 向上述离心管中滴入固定液 0 5 毫升 用滴管小心冲打成悬液 从冰箱的冰格中或冰水 中取出载玻片 每片滴加悬液 1 3 滴 用嘴轻轻吹散 用电吹风吹干 或在酒精灯火焰上微微烤干 11 染色 染色 用磷酸缓冲液 pH7 4 稀释后的姬姆萨染色液染色 20min 然后倒去染液 用蒸馏水轻轻 冲洗 12 镜检 镜检 待稍午后 在显维镜下检查 先用低倍镜寻找良好的分裂相 然后用高倍油镜观察 13 封片 封片 用加拿大树胶封片 选择染色体清晰 分散度好 的细胞进行显微摄影 进行核型分析 见图 20 1 图 20 1 人体外周血培养与染色体标本制作示意图 4 六 实验注意事项六 实验注意事项 1 接种的血样愈新鲜愈好 最好是在采血后 24h 内进行培养 如果不能立刻培养 应置于 4 存放 避免保存时间过久 会影响细胞的活力 2 在培养中成败的关键 除了至为重要的 PHA 的效价外 培养的温度和培养液的酸碱度也十分重 要 人的外周血淋巴细胞培养最适温度为 37 0 5 培养液的最适 pH7 2 7 4 3 培养过程中 如发现血样凝集 可将培养瓶轻轻振荡厂使凝块散开 继续放回 37 恒温箱内培 养 4 制片过程中 如发现细胞膨胀得不大 细胞膜没有破裂 染色体聚集一团伸展不开 可将固定 时间延长数小时或过夜 七 实验结果七 实验结果 1 核型分析 人类每个体细胞有 46 条染色体 22 对常染色体和一对性染色体 男子是 46 XY 女子是 46 XX 见图 20 2 图 20 2