成年鼠骨髓单个核细胞在体外培养中分化为平滑肌祖细胞

【摘要】 目的：探讨大鼠骨髓单个核细胞在体外经条件培养基诱导定向分化成平滑肌祖细胞的可行性。方法：分离 46 周龄的大鼠胫骨、股骨，以 4预冷的 DMEM 培养基冲出骨髓，密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，在血小板源生长因子-BB （ PDGF-BB）和碱性成纤维细胞生长因子 （ b-FGF）作用下，培养 812d 形成贴壁的梭形细胞。采用 CD34 与 -SMA 免疫荧光染色进行鉴定，RT-PCR 法测定其 -SMA mRNA 表达情况。结果： 在 PDGF-BB 作用下，82%的骨髓单个核细胞 -SMA 染色阳性，78%细胞CD34 染色阳性，新鲜分离的骨髓单个核细胞不表达 -SMA mRNA，体外培养后表达 -SMA mRNA。结论：体外培养的骨髓单个核细胞能分化为平滑肌祖细胞，可作为研究平滑肌细胞分化和筛选抑制再狭窄药物的工具。 【关键词】 骨髓细胞；干细胞；肌细胞，平滑肌Bone marrow mononuclear cells of adult rat to differentiate into smooth muscle progenitor cells in vitro/ZHANG Po, HUNAG Lan, SONG Ming|bao, ZHAO Xiao|Hui，CUI Bin, ZHOU Yin|pin, YIN Yang|guang, ZHU Guang|xu/Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2007，16（2）：128 Abstract：Objective:To explore the potential of rat bone marrow mononuclear cells (MNCs) to differentiate into vascular smooth muscle progenitor cells.Methods:After the tibias and femurs were dissected from 46 week|old rats, the marrow was flushed out with ice|cold DMEM mediumThe MNCs were obtained with density gradient centrifugation and cultured in DMEM medium containing 20%FBS, 50ng/ml Platelet|derived growth factor-BB(PDGF-BB), 10ng/ml basic fibroblast growth factor(b-FDF).The cultured cells in vitro were identified with smooth muscle cell|specific actin (-SMA) and CD34 by immunofluorescent techniqueRT-PCR technique was used to identify the -SMA mRNA level in fresh isolated marrow mononuclear cells and SPCs.Results:Smooth muscle|like cells outgrew from the culture of MNCs in presence of PDGF-BB and b-FGF.These cells were positive stain for -SMA and CD34 on immunofluorescence-SMA mRNA was not expressed in fresh isolated MNCs but in the cells cultured for 8-12 days.Conclusion:Vascular smooth muscle cells can outgrow from bone MNCsThis model may be useful in study of smooth muscle cell differentiation and the origin of neo|intimal cells after vascular injury. Authorsaddress：Cardiovascular Research Institute of PLA, Xinqiao Hospital of the Military Medical University, Chongqing 400037, China Key words：Bone marrow cells; Stem cell; Muscle cell,smooth muscle 成年机体外周血中存在一种 CD34 阳性，血小板源生长因子-BB（Platelet|derived growth factor, PDGF-BB）受体阳性，与造血干细胞具有多种相同表面抗原的细胞群，在体外培养能够增殖，并逐步分化成为平滑肌细胞，在体内可被血管损伤动员，参与损伤血管修复和病理性新内膜的生成，因此这种细胞被认为是循环平滑肌祖细胞（smooth muscle progenitor cells, SPCs）1, 2。正常动物外周血中 SPC 含量很低3 ，分离培养困难。骨髓作为外周造血干细胞的产生组织，其中是否存在 SPCs，在体外是否可以分化成平滑肌细胞，目前尚不清楚，本研究旨在为研究平滑肌细胞分化调控和血管损伤后新生内膜增生发病机制提供新的实验佐证。 1 材料与方法 11 实验材料 DMEM 培养基购自 GIBCO 公司，优质胎牛血清购自 PAA 公司，淋巴细胞分离液购自 TBD 公司，胰酶、纤维连接素、PDGF-BB 等购自 Sigma 公司。 12 实验动物 Wistar 大鼠，56 周龄，雌雄不拘（第三军医大学实验动物中心提供） 。 13 实验方法 131 平滑肌祖细胞培养：将大鼠脱臼处死后置于 75%酒精浸泡约 4 min，无菌条件下分离出大鼠的股骨和胫骨。用 4预冷的无血清培养基冲出骨髓，吸管轻柔吹打，制成单细胞悬液。按等体积比在试管中加入淋巴细胞分离液，将单细胞悬液缓慢加在分离液上，4，500g 离心 30 min，取中间的单个核细胞层，用无血清培养基清洗 2 次，用DMEM 培养基（含 PDGF-BB 50 ng/ml，青、链霉素各 100 U/ml，胎牛血清 20%）调整细胞密度，以 2106/cm2 的密度接种于纤维连接素包被的培养板中，置 37、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。4 d 后更换培养基，去除非贴壁细胞，以后每 3 d 换液 1 次。710 d细胞生长融合，选取生长良好的细胞进行下列实验。 132 免疫组化鉴定：将细胞培养在清洁灭菌的盖玻片上，细胞融合前用 4 %多聚甲醛固定 15 min，PBS 洗 3 次，03%TritonX-100 固定通透 20 min，经 PBS 缓冲液洗涤3 次后，用 5 %山羊血清封闭 30 min。加第一抗体 4冰箱过夜，随后用 PBS 缓冲液洗涤3 次，每次 5 min，加入荧光标记第二抗体孵育 30 min，经 PBS 洗涤后甘油封片，荧光显微镜观察，计算 100 个细胞中阳性细胞的百分比。 133 RT-PCR 分析：用 Tripure 提取细胞总 RNA，根据大鼠平滑肌细胞特殊的 肌纤蛋白（-SMA） cDNA 全长序列( Genebank X06801) 用 Primer 50 软件设计上、下游引物，sense：5CCCTGAAGTATCCGATAGAACACG 3，anti sense：5CCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT 3，目的片段长度为 277 bp。内参照采用-actin，引物序列为：sense：5 CTGCCGCATCCTCTTCCTC 3，anti sense： 5 CTCCTGCTTGCTGATCCATAT 3，目的产物长度为 398 bp。引物由上海基康公司合成。RT-PCR 反应程序：42 逆转录 3 h，94 变性 5 min，共 30 个循环进行扩增反应。循环参数：94 变性 30 s，54 退火 1 min，72 延伸 1 min，末次循环后 72 延伸 10 min。取 RT-PCR 扩增产物 10l 进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，照相。 2 结 果 21 原代培养过程在接种 24 h 后，部分贴壁细胞呈梭形，可见数个细胞组成的小集落形成，1 周后集落迅速增多，并且逐渐长大融合成片，大部分细胞为梭形，部分细胞为三角形，其间少量圆形细胞，随传代转化为梭形（图 1，见封三） 。传代培养的细胞不再呈集落方式生长，而是呈均匀分布生长，细胞形态基本不变。 22 培养细胞的分化鉴定在 PDGF-BB 作用下，培养细胞免疫荧光染色平滑肌细胞特异标志蛋白 -SMA 阳性（图 2，见封三） ，阳性率约为 82%。无 PDGF-BB 情况下则无-SMA 表达。新鲜分离的骨髓单个核细胞不表达 -SMA mRNA，培养 10 天的细胞表达-SMA mRNA（图 3，见封三） 。 23 培养细胞表达 CD34 造血干细胞标志：培养细胞免疫荧光染色 CD34 表面蛋白阳性，阳性率约为 78%（图 4，见封三） 。 3 讨 论血管中膜平滑肌细胞迁移、过度增殖、合成大量胞外基质是动脉粥样硬化的重要病理生理基础。病理学检查发现粥样病损中的平滑肌细胞存在明显异质性，提示除中膜平滑肌细胞迁移外，可能存在其它来源的平滑肌细胞参与损伤血管的重构。Saiura 等4研究移植物血管病时发现，移植物血管病变处大部分 SMC 来源于受体鼠，而非预想的来自于供体心脏本身，定量分析发现，病损处 825%的细胞是受体来源的5。Sata 等5发现高脂血症诱发的动脉粥样硬化动物模型中，新生内膜中约 425%的平滑肌细胞是骨髓来源的，而且这些骨髓来源细胞是合成型平滑肌细胞。这些发现均提示骨髓源细胞参与了损伤血管修复和病理性新内膜形成。了解骨髓源 SPC 动员、损伤区归巢、分化、增殖等生物学行为，有助于加深我们对血管损伤后新内膜形成的认识，为再狭窄的防治提供新的思路。Fukuda等1研究发现人外周血单个核细胞在 PBGF-BB 作用下可分化为平滑肌祖细胞。我们在研究中发现，在 PBGF-BB 作用下，骨髓单个核细胞在体外也可分化为血管平滑肌细胞，这些细胞为梭形，免疫荧光染色证实骨髓源平滑肌细胞表达 -SMA，RT-PCR 分析显示细胞表达 -SMA mRNA。正常情况下，动物外周血中 SPC 含量很低3，在严重血管损伤或G-CSF 动员剂作用下，骨髓中 SPC 被动员入外周血，参与病理性新生内膜生成。利用未动员外周血分离培养 SPC 较为困难。骨髓是许多干祖细胞贮藏库，正常情况下，多种干细胞含量均较外周血高。我们采用骨髓细胞分离培养 SPC 获得成功。中膜平滑肌细胞在胚胎起源复杂，其分化受多种细胞因子调控6。近来研究发现，在 PDGF-BB 作用下，胚胎干细胞来源的血管祖细胞可分化为平滑肌细胞，而 PDGF-CC 无此作用7。韩雅玲等8研究发现，平滑肌细胞条件培养基也可诱导骨髓单个核细胞分化为平滑肌细胞，作者认为微环境依赖的定向分化是细胞分化的重要机制。我们发现，在 PDGF-BB 作用下，骨髓单个核细胞可分化为血管平滑肌细胞。Simper 等7研究发现人外周血单个核细胞在 PDGF-BB 作用下可分化为平滑肌细胞。PDGF-BB 是刺激血管平滑肌细胞增殖的重要有丝分裂原，在血管损伤局部和粥样病损处表达上调，其分布与过度增生的平滑肌一致。我们以往研究发现，骨髓单个核细胞在 VEGF 作用下，可分化为有功能的血管内皮细胞，能够参与缺血区新血管生成9。结合 Simper 的研究和当前研究结果，提示在血管损伤局部，PDGF-BB 与骨髓细胞相互作用，促进新内膜形成，说明骨髓中不仅存在内皮祖细胞也存在平滑肌祖细胞。关于骨髓源平滑肌细胞起源，目前仍无定论。韩雅玲等8认为骨髓源平滑肌细胞起源于骨髓间质细胞。CD34 是造血干细胞的重要标志，正常血管平滑肌不表达 CD34 标志蛋白。我们发现当前实验条件下分离的平滑肌细胞 78%以上表达 CD34 造血干细胞标志。一种可能的解释是 CD34+细胞是高度异质的，包含有更原始的间质细胞和血管祖细胞。已有研究显示高脂血症诱发的动脉粥样硬化新生内膜中大量平滑肌细胞 CD34 染色阳性10。PCI 后冠状动脉 CD34 阳性细胞数量与再狭窄发生正相关11。骨髓 CD34 阳性细胞在血管损伤修复中的确切作用需今后实验证实。参考文献：1 金倩;氯地酊联合激光治疗痤疮 158 例疗效观察J;广东医学;1997 年 10 期 2 董新亭,李卫莉,张随学;自拟粉刺消治疗痤疮 126 例J;中国中医药科技;1999 年 06 期 3 查旭山,陈修飏;寻常痤疮治疗体会J;江西中医药;/xyfm/class/.2002年 05 期 4 张随学 ,谭正辉 ,孙叶梅 ,李梅 ,俞玉芳 ,韩峰;3003 例痤疮患者特征分析与控制对策J;中华医学美学美容杂志;/xyfm/class/.2002 年 06 期 5 刘勇,王冬梅;痤疮的药物治疗J;临床医药实践杂志;2003 年 09 期 6 高宜云;痤疮从肝论治J;中医药临床杂志;2004 年 03 期 7 欧其平,林维山;中西医结合治疗痤疮J;中华皮肤科杂志;2004 年 09 期 8 陈五一;痤疮辨治