动物细胞培养-实验内容

1 细胞工程实验技术 动物细胞培养部分 目 录 实验一实验一 实验器材的清洗 包装和消毒实验器材的清洗 包装和消毒 1 实验二实验二 常用的仪器设备介绍常用的仪器设备介绍 2 实验三实验三 常用动物细常用动物细胞胞培培养用液的配制养用液的配制 2 实验四实验四 组织块原代培养 传代培养及生物学检测组织块原代培养 传代培养及生物学检测 4 实验五实验五 心肌细胞的原代培养 传代培养及培养细胞的常规检查心肌细胞的原代培养 传代培养及培养细胞的常规检查 6 2 实验一实验一 实验器材的清洗 包装和消毒实验器材的清洗 包装和消毒 一 实验目的 1 掌握细胞培养常用实验器材的清洗要领 清洗步骤和注意事项 2 掌握细胞培养常用器材的包装要领和要求 3 掌握正压滤器的安装 使用和拆除方法及操作注意事项 二 实验用品 以组为单位包装物品 1 量筒 100mL 500mL 2 大 小烧杯 3 个 3 1000mL 容量瓶 1 4 移液管 1mL 3 灭菌 5 100mL 250mL 500mL 盐水瓶 500mL 广口瓶 各 4 灭菌 6 眼科剪刀 眼科镊子各 2 把 灭菌 7 细胞培养瓶 3 灭菌 其它 饭盒 青霉素瓶 牛皮纸 离心管 滴管 注射器 磁棒 绳 标签纸等杂干 三 实验内容 一 清洗 1 要领 浸泡 刷洗 酸泡 2 步骤 洗衣粉浸泡 12h 刷洗 流水震荡冲洗 15 20 遍 漓水 蒸馏水洗荡 2 次 37 烘干 待包装 3 注意事项 1 使用后的器材要立即投入水中 2 器皿内要充满液体 不得有气泡 3 器材要用流水震荡干净 二 包装 1 大的器材如 量筒 广口瓶 培养皿 吸管等要包装 2 小的器材如 注射器 剪刀 镊子放入饭盒 3 注意事项 1 包装时手指与器材接触面积要小 手指不能触及器材使用端 2 封闭器材使用端 标记器材手持端 3 小包装 4 玻璃管道口加棉花 三 湿热消毒 高压灭菌锅消毒 四 作业 1 清洗的要求为何较高 你认为该如何保证器皿中无杂质 2 器材包装有何要求 3 3 实验二实验二 常用的仪器设备介绍常用的仪器设备介绍 一 实验目的 了解动物细胞培养中常用仪器设备的使用方法 注意事项和保养方法 二 实验用品 1 超净工作台 2 自动双重纯水蒸馏器 3 高压蒸气灭菌器 4 过滤器 5 电热恒温干燥箱 6 二氧化碳培养箱 7 冰箱 8 倒置显微镜 三 实验内容 1 了解超净工作台的工作原理 2 自动双重纯水蒸馏器结构 使用注意事项 3 高压蒸气灭菌器的工作原理 4 正压过滤器的使用方法 5 二氧化碳培养箱的使用方法 四 作业 1 叙述超净工作台的工作原理 2 正压过滤器为何会除菌 4 实验三实验三 常用动物细胞培养用液的配制常用动物细胞培养用液的配制 一 实验目的 掌握常用动物细胞培养用液的组成及配制方法 二 实验用品与仪器 量筒 烧杯 广口瓶 天平 各种无机盐 三 实验内容 一 平衡盐溶液的配制 1 平衡盐溶液的配方如下 NaClKClCaCl2MgSO4 7H2ONa2HPO4 2H2OKH2PO4NaHCO3葡萄糖苯酚红 Hanks8 000 400 140 200 060 060 351 000 02 D Hanks8 000 400 060 060 350 02 I 组配 Hanks 1000mL V 组配 D Hanks 1000mL 其他各组不配平衡盐溶液 2 配制方法 以 Hanks 液为例 1 甲液 用约 100mL 蒸馏水溶解 CaCl2 2 乙液 用约 750mL 蒸馏水溶解 Na2HPO4 2H2O KH2PO4 MgSO4 7H2O 葡萄糖 NaCl KCl 3 将甲液徐徐加入乙液中 4 将 0 35gNaHCO4溶解在 100mL 蒸馏水中 5 用数滴 NaHCO4液溶解 0 02 克酚红 6 将 4 5 液移入 3 液中 7 用双蒸水定容至 1000mL 充分混匀 调节 PH 为 7 4 4 冰箱过夜 8 滤过消毒 小瓶分装 500mL 250mL 2 冷藏 3 配制要求 1 配制后液体呈桃红色 PH7 4 左右 没有混浊和沉淀 2 含 Ca Mg 的物质要单独溶解 3 用于分离细胞的消化液宜用无 Ca Mg 离子的 D Hanks 液或 PBS 液配制 二 200mmol l L 谷氨酰胺 10mL II 组配 方法 称取 0 292g M146 12 双蒸水 10mL 滤过除菌 20 保存 使用 每 100mL 培养基加 1mL L 谷氨酰胺 三 抗菌素液 青霉素 链霉素 III 组配 1 方法 10mL Hangks 液或双蒸水溶解 100 万链霉素 再用 8mL 链霉素溶解 80 万 u 的 青霉素 成每毫升青霉素 链霉素各 10 万单位的母液 2 使用 100mL 培养液加青 链霉素母液 0 1mL 四 RPMI 1640 基础培养液的配制 IV 组配 甲液 RPMI 1640 10 4g Hepes 2 7g 双蒸水 700mL 搅拌至颗粒完全溶解 橙红色 乙液 NaHCO3 2 2g 双蒸水 30mL 30min 颗粒完全溶解 5 将甲 乙两液混合 加水至终 1000mL 定容 4 冰箱静止 2 3h 滤过除菌 分装 250mL 250mL 500mL 无菌试验 写好组号 20 保存 注意 用三天内制备的蒸馏水配制 培养基各成分是否完全溶解的判断方法 将培养液置 室温或 4 冰箱静止 30min 观察瓶底有无颗粒产生 五 5 6 NaHCO4液 100mL V 组配 方法 用双蒸水 100mL 配制 滤过除菌 分装于广口瓶 4 冰箱保存 使用时 NaHCO4液要逐滴加入 并不时搅动培养液 以防 PH 过高 六 0 25 胰蛋白酶溶液 400mL VI 组配 1 250 的胰蛋白酶 Trypsin 粉 1 0g D Hanks 400mL 先用少量 D Hanks 溶解胰蛋白酶 再将剩下的液体加入混合 置 37 水浴中 1h 左右 待 彻底溶解 液体呈透明为止 用 5 6 NaHCO4调整 pH 至 7 6 7 8 用 0 22 微型滤膜抽滤 分装置 4 冰箱中保存 七 0 02 EDTA 乙二胺四乙酸二钠 溶液 200mL VI 组配 方法 称取 EDTA 4g 200mL D Hanks 液 0 02 滤过除菌 备用 四 思考题 1 配制后液体呈黄色意味着液体的 PH 发生了什么变化 2 用于分离细胞的消化液为什么宜用无 Ca Mg 离子的 D Hanks 液或 PBS 液配制 3 L 谷氨酰胺在营养液中有何作用 4 营养液制备后为什么要小剂量分装 6 实验四实验四 组织块原代培养 传代培养及生物学检测组织块原代培养 传代培养及生物学检测 一 实验目的 掌握组织块原代培养 传代培养的基本方法和操作特点及生物学检测的基本方法和操作要 点 二 实验器材与用品 1 肝组织 2 平衡盐 BSS 液 各组自己配的 100mL 3 细胞培养皿 4 完全培养液 5 灭菌培养皿 1 个 人 6 眼科剪 镊子 吸管等 7 0 4 台 盼蓝 8 血球计数板和盖玻片 三 实验步骤 一 组织块原代培养 1 将一小块肝组织置于灭菌培养皿中 用 Hanks 或 D Hanks 液漂洗表面 吸净 Hanks 或 D Hanks 用眼科剪反复剪成 1 2mm3大小 约需 20 30min 2 吸管吸取 1 2mL Hanks 或 D Hanks 液吹下剪刀中的碎块 然后 反复吹打 静置片刻 吸除上清 BSS 3 用吸管吸取小块肝组织于培养瓶底部 均匀 间距离 0 5cm 为宜 加少量培养液 维持 湿润即可 4 次日 组织贴壁后 再补加营养液 5 37 温箱培养 24 48 后观察 二 组织块传代培养 1 将长成单层的原代培养组织块从二氧化碳培养箱中取出 在超净工作台中倒掉瓶内的培养液 加 入少许消化液 0 25 胰蛋白酶溶液 以液面盖住细胞为宜 静置 5 10 分钟 2 在倒置镜下观察被消化的细胞 如果细胞变园 相互之间不再连接成片 这时应立即在超净工作 台中将消化液倒掉 加入 3 5mL 新鲜培养液 吹打 制成细胞悬液 3 将细胞悬液吸出 2mL 左右 加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加 3mL 左右培养液 盖好瓶 塞 送回二氧化碳培养箱中 继续进行培养 三 组织培养细胞的常规检查 1 营养液 PH 值的检查 1 新鲜的培养液呈橙红色 2 细胞生长旺盛 代谢酸性产物增多 营养液酸性变黄 3 培养瓶若刷洗不洁 残留碱性物质 致营养液 PH 增高 呈紫红色 一般情况下 每 周换液 2 次 每次换半量或 1 3 量 2 微生物的污染与排除 1 细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测 污染的细菌量比较大 增殖的细菌就可以导致培养液外观浑浊 肉眼就可以判断 细菌污 染大多数可以改变培养液 pH 使培养液变浑浊 变色 用相差显微镜观察 可见满视野都 是点状的细菌颗粒 原来的清晰培养背景变得模糊 大量的细菌甚至可以覆盖细胞 对细 胞的生存构成威胁 用青霉素 链霉素可以预防细菌污染有效 2 真菌污染对细胞的影响及污染物的检测 大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面 肉眼可见 有的散在生长 镜下可见呈丝状 管状 树枝状 纵横交错穿行于细胞之间 3 支原体污染对细胞影响及污染物的检测 支原体污染后 因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存 培养基一般不发生浑浊 7 细胞无明显变化 外观上给人以正常感觉 实则细胞受到多方面潜在影响 如引起细胞变 形 影响 DNA 合成 抑制细胞生长等 四 思考题 1 你认为该如何操作才能保证培养过程中无微生物污染 2 你认为组织块培养成功需哪些条件 3 原代细胞和传代细胞培养有哪些区别 8 实验五实验五 心肌细胞的原代培养 传代培养及培养细胞心肌细胞的原代培养 传代培养及培养细胞 的常规检查的常规检查 一 实验目的 掌握心肌细胞培养的基本方法和操作特点 为传代培养作好准备 二 实验器材与用品 1 鹌鹑的心脏 2 平衡盐 BSS 液 各组自己配的 100mL 3 细胞培养瓶 每人一个 4 完全培养液 5 灭菌培养皿 1 个 人 6 眼科剪 镊子 吸管等 7 0 25 胰蛋白酶液 8 0 02 EDTA 液 9 无菌离心管 10 100 目铜筛 三 实验内容 一 原代培养实验步骤 1 取材 1 取一只鹌鹑 断颈处死 用 75 酒精浸泡消毒 2 在超净工作台中操作 剪开胸壁 取出心脏 放入 Hanks 或 D Hanks 液中 3 用 Hanks 或 D Hanks 液冲洗心脏后 剪去心房 取心室肌 然后 用 Hanks 或 D Hanks 液冲洗 3 次 2 漂洗与剪切 1 将心室肌置于无菌培养皿中 剪成 10 块左右的小块 用 Hanks 或 D Hanks 清洗 2 次 吸去多余的液体 2 用眼科剪反复剪切成 1 mm3左右大小 约需 20 30min 3 消化 1 无菌培养皿中的小组织块用 Hanks 或 D Hanks 液冲洗 移入离心管中 盖好盖子 请 注意无菌操作 低速离心 500 800r min 7min 2 用吸管去除上清液 加入沉淀量 5 8 倍的 0 25 胰蛋白酶液 37 水浴摇晃 20min 用吸管吹打组织块 以分离细胞 然后 加入完全培养液约 5mL 终止消化 4 制备单细胞悬液 1 将上述悬液 500 800r min 7min 吸除上清液 2 用 BSS 液漂吸 2 3min 用吸管反复轻打松散组织 离心去上清液 共两次 3 去上清液后加 15mL 细胞培养液 混匀计数约 5 105个 mL 5 接种 1 25mL 培养瓶中先加入 1 5mL 培养液 再接种 1mL 细胞悬液 2 持瓶左右 上下轻轻摇晃 移入 37 5 CO2恒温箱培养 根据细胞生长情况 每隔 2 3 天换液 1 次 二 传代培养实验步骤 1 取原代培养物 吸除原瓶内旧培养液 轻轻摇晃培养瓶 将细胞振入培养液内 将悬浮 在培养液中的细胞移入离心管中 2 消化 1 向瓶内加入胰蛋白酶 0 5mL 和 EDTA 液 0 5mL 约 5 8min 需终止消化 加基 础培养液 1mL 2 收集消化下来的细胞 归入前离心管中 500 800r min 5min 去除上清液 9 3 分瓶培养 沉淀物加少量完全培养液 摇匀 分别接种到两个新的培养瓶内 每瓶再补 加 2 0mL 培养液 十字形混匀细胞 5 CO2恒温箱培养 三 细胞培养的生物学检查 1 处理贴壁生长细胞时 吸出培养液 每瓶加入消化液各 0 5mL 在 37 下消化 1 2min 后 加入约 10mL 培养液 用吸管冲洗细胞 制成细胞悬液 取 0 5mL 台盼蓝溶液 0 3 mL Hanks 或 D Hanks 液和 0 2 mL 细胞悬液 充分混匀 然后 将混合液放置 5 15min 2 用吸管吸取少量混合液 注入血细胞计数板小室 将盖玻片放在计数板上 用吸管吸取 少量细胞悬液 充满间隙 在显微镜 100 倍放大用计数器计数 4 个大方格中的细胞 3 至少计