苏木素与胰蛋白酶作用的性质研究

1 / 7苏木素与胰蛋白酶作用的性质研究作者：黄忠林， 宋九华， 王应红【摘要】目的认识苏木素对胰蛋白酶作用活性的影响及苏木素对胰蛋白酶作用的荧光性质。方法用酶活性法观察苏木素对胰蛋白酶活性的影响；用紫外光谱和荧光光谱研究苏木素对胰蛋白酶作用的光谱性质。结果苏木素对胰蛋白酶活性可产生竞争性抑制，抑制剂常数 K1=10-5 mol/L；苏木素对胰蛋白酶的荧光猝灭效应为静态猝灭；苏木素与胰蛋白酶之间的作用力主要表现为氢键和范德华力。结论苏木素可使胰蛋白酶分子中的色氨酸所处环境的疏水性增强，使胰蛋白酶分子构象发生变化。 【关键词】 苏木素 胰蛋白酶 荧光光谱 紫外光谱 酶活性中药苏木的主要成分苏木素(Haematorylin)是组织、病理实验室中最常用的染色剂，可用于细胞核染色1 。苏木素具有收缩血管、中枢抑制及抗炎等作用，具有行血、破淤、消肿、止痛的功效2 。胰蛋白酶(trypsin)是人和动物肠道中一种重要的蛋白水解酶，从该酶被发现以来，人们对其进行了一定的研究，如用胰蛋白酶为催化剂对蛋白质进行降解的研究35 。药物对胰蛋白酶作用的性质6及苏木素与 DNA 作用的性质的研究已引起重视7 。2 / 7主要通过紫外和荧光光谱法研究苏木素与胰蛋白酶作用的性质，从而获得苏木素与胰蛋白酶作用时结构变化、所处微环境等信息，探讨苏木素与胰蛋白酶相互作用的机制，并对苏木素与胰蛋白酶作用活性的影响也进行了研究。1 器材仪器荧光分光光度计，美国 Cary Eclipse 产品；双光束紫外可见分光光度计 TU1901，北京普析产品；pH3C 型酸度计，上海精密科学仪器有限公司产品。药品牛胰蛋白酶，上海海洋生物技术有限公司产品；苏木素，成都科龙化工试剂厂产品；硼酸，成都科龙化工试剂厂产品。2 方法苏木素对胰蛋白酶活性影响在恒温水浴箱中将酪蛋白、胰蛋白酶和苏木素预热，按酶活性的测定方法，在胰蛋白酶与酪蛋白的酶解反应体系中加入不同体积的苏木素溶液，测定苏木素对酶活性的影响。胰蛋白酶活性及抑制常数测定参照文献8方法操作。苏木素对胰蛋白酶紫外光谱的影响配制 pH的硼酸缓冲溶液；用硼酸缓冲溶液配制10-4mol/L 的胰蛋白酶溶液，再用 3 次蒸馏水分别配制10-3mol/L 和10-3mol/L的苏木素溶液。室温条件下，在 1 cm1 cm 的石英比色皿中准确3 / 7加入10-4mol/L 的胰蛋白酶溶液 ml，扫描 190350 nm的吸收光谱。然后用微量注射往其中准确加入10-3mol/L的苏木素溶液 10 l，混匀，静置 2 min 后扫描 190350 nm 的吸收光谱。扫描10-3 mol/L 苏木素溶液 190350 nm 的吸收光谱。苏木素对胰蛋白酶荧光光谱影响在 1 cm1 cm 的石英比色皿中准确加入 10-4mol/L 的胰蛋白酶溶液 ml，用微量注射器分别加入10-3mol/L 的苏木素溶液0，10，20，30，40，50，60，70 l。每次加入后混匀，放置 5 min，分别在 20，25，30，35下，测定其荧光光谱，激发波长为 280 nm，绘制 288450 nm 的荧光光谱。苏木素对胰蛋白酶作用的同步荧光将“”项下所配的温度为 298 K 的溶液，固定激发和发射波长间隔 分别为 20 nm 和 60 nm，同时扫描激发和发射波长并记录同步荧光光谱。3 结果 苏木素对胰蛋白酶活性的影响苏木素对胰蛋白酶有抑制作用，当苏木素浓度为10-4 mol/L 时，苏木素使胰蛋白酶的相对活性下降到%，抑制率为%。在不同的底物浓度下，按酶活性的测定方法测定酶的反应速度，其结果以1/v 对抑制剂量用 Dixon 作图法求出 Ki=10-5mol/L，抑4 / 7制类型为非竞争性抑制。苏木素对胰蛋白酶紫外吸收光谱影响图 1 为T298K，pH时的吸收光谱。蛋白质分子中的色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸残基均有紫外吸收，蛋白质的吸收波长一般在 280 nm 附近。从图 1 可以看出，当往胰蛋白酶中加入苏木素后，混合溶液在 280 nm 附近的吸收峰均明显增高，说明苏木素与胰蛋白酶之间发生了作用，改变了胰蛋白酶的构象,而这种作用有利于胰蛋白酶分子中色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸残基的 *电子跃迁。荧光光谱以 ex280 nm，胰蛋白酶在 354 nm 附近有很强的荧光峰；而以同样激发波长激发苏木素溶液，在 354 nm 附近则没有荧光峰，证明苏木素不会产生与胰蛋白酶干扰的荧光。固定胰蛋白酶的量，随着体系中苏木素浓度的增加，胰蛋白酶的内源荧光产生有规律的猝灭，其最大发射波长未发生明显的变化。荧光猝灭常数及猝灭机理苏木素对胰蛋白酶的猝灭效应一般情况下，可依据不同温度下的结果区别是动态猝灭，还是静态猝灭。对于动态猝灭，随着温度升高，将增加离子有效碰撞的数目，加剧电子的转移，使荧光物质的猝灭常数随温度的升高而5 / 7增大。而对于静态猝灭则温度升高将降低复合物的稳定性，使猝灭常数减小。以相同的实验条件，分别测定了在20，25 下胰蛋白酶的荧光猝灭光谱，以F0/F1对C作 SternVolmer 图见图 3。从图 3 可以看出苏木素在温度低于 25时猝灭常数随温度的升高而降低，即符合静态猝灭机理。当猝灭体分子和荧光物质分子之间形成新的复合物而发生静态猝灭时，服从 Lineweaver-Burk 方程。20，25时以1 对C1 拟合 Lineweaver-Burk 方程，由图 4 可见该双倒数呈现良好的线性关系，再次确定在 20，25时为静态猝灭。结合位点数 n 及结合常数 KA 的计算设苏木素与胰蛋白酶形成 n 个结合点位的复合物则有：Lg/FlgKA+nlgC分别作不同温度下 Lg/FlgC的双对数拟合，得到不同温度下的 KA 和 n 见表 1。表 1 苏木素与胰蛋白酶的结合常数，结合位点数及相应的相关系数作用力类型的确定猝灭体与生物大分子之间的相互6 / 7作用力主要有氢键、范德华力、静电引力和疏水作用力。根据以下公式计算。结果见表 2。表 2 苏木素与胰蛋白酶作用的热力学参数ln(K2/K1)=H(1/T1-1/T2)/RG=-RTlnK S=(H-G) /T由上可知，H0 和S0，可以说明苏木素与胰蛋白酶之间的作用力主要表现为氢键和范德华力9 。苏木素对胰蛋白酶构象的影响固定激发波长与发射波长的间距，扫描同步荧光光谱，这种光谱可用于蛋白质构象变化的分析,由(a)20 nm 所得到的同步荧光光谱图仅显示的是酪氨酸残基的荧光，(b)60 nm 时仅表现出色氨酸残基的荧光，由图 5 可以看出在此实验条件下，酪氨酸和色氨酸残基荧光同时被猝灭，使其荧光强度下降，酪氨酸残基的最大发射波长没有发生改变，但色氨酸残基的最大发射波长发生了蓝移，表明色氨酸基所处环境的疏水性增强，引起了胰蛋白酶的构象变化。 4 结论7