免疫学技术免疫血清制备

抗体制备,一、免疫动物,动物选择：种类多。哺乳类或禽类。选择适龄、健壮的动物原则：需要血清量、抗原从何种种属动物分离获得，需要单抗时，有多少抗原可使用。常用种类：兔、小鼠、大鼠、豚鼠、中国仓鼠商品用动物：猪、马、牛、羊多抗制备常用兔（得到500ml血清！）,多克隆抗体制备,动物选择,动物 血清最大量 单抗可能性 纯系 评价,兔 500 有可能 否 常用于多抗制备小鼠 2 是 是 常用单抗制备大鼠 20 是 是 生产单抗中国仓鼠 20 否 否 抗原少时生产多抗豚鼠 30 否 否 难以采血鸡 50 否 否 对高度保守的哺乳动 物抗原较好,小鼠6周左右成熟，大鼠6-8周，兔12周成熟数量：小鼠3-5只，兔最少两只,抗原及抗原剂量的选择：所用抗原应具备抗原特异性和较高的纯度。而且可被降解抗原剂量根据其种类、免疫次数、注射途径及动物种类、免疫周期等不同。抗原剂量过低或过高均不能诱导产生抗体在一定范围内，抗体效价随注射抗原剂量而增高,二、抗原,抗原溶液最好为中性生理学缓冲液（如PBS）从丙烯酰胺凝胶中纯化抗原：电泳后蛋白定位、制备凝胶碎片（对于大动物）、电洗脱凝胶、转膜（硝酸纤维素膜）后超声半抗原：交联载体（BSA，KLH，蓝载体）多肽抗原：肽长度、合成难度，肽的活动性。最安全的选择是制备多个不同区域的10-15个氨基酸的合成肽。偶联策略,小鼠：首次50-100ug/次；大鼠：100ug-1mg/次，兔0.5-1mg/次加强免疫的剂量为首次剂量的1/5-2/5高度特异性抗血清：策略为低剂量抗原短程免疫法高效价的抗血清：策略为大剂量抗原长程免疫法。,三、佐剂的应用,颗粒性抗原或全细胞抗原不需要佐剂可溶性抗原须用佐剂，以增强抗原的免疫原性或改变免疫反应的类型，刺激机体产生较强的免疫应答佐剂种类：弗氏（Freunds）佐剂、脂质体佐剂、氢氧化铝佐剂，SAF-1和RASIFA：羊毛脂1份，石蜡油5份，每毫升IFA中加入1-20mg卡介苗即为CFA。,四、注射途径,兔：较大体积注射采用多点皮下小鼠：大体积颗粒性抗原通过腹腔注射、皮下注射（含佐剂可溶性抗原），静脉注射不适于颗粒性抗原或含佐剂。缓慢释放抗原：肌肉或皮下注射、皮下注射立即释放抗原：静脉注射（常在强化免疫时用）静脉注射防止发生过敏性休克含佐剂的抗原不可只在一点注射,五、加强免疫,兔：3-6周注射一次，避免每两周加强免疫，持续使动物暴露于免疫原，循环抗体降低加强免疫效应小鼠：2-3周加强免疫一次,用于小鼠的免疫原推荐剂量、免疫方式,抗原类型 例子 基础或加强免疫 终加强免疫 途径 剂量 佐剂 途径 剂量 佐剂,可溶性蛋白 酶等 ip,sc 5-50ug + iv 5-50ug -颗粒性蛋白 病毒、细菌 ip,sc 5-50ug + iv 5-50ug -不溶性蛋白 包涵体等 ip,sc 5-50ug + iv 5-50ug -活细胞 ip 105-107 - iv 106 -活瘤细胞 ip 104-106 - iv 106 -碳水化合物 ip 10-50ug iv 10-50ug -,六、免疫效果评价,检测免疫血清以免疫前血清作为阴性对照鉴定抗体特异性、效价、交叉反应性。方法：ELISA，Western Blot等,单克隆抗体制备,七、抗体纯化,硫酸铵沉淀法：简易价廉、浓度高，但纯度不高辛酸沉淀法：纯化IgG类抗体，价廉，但纯度不高DEAE柱层析法：起始抗体PH只高于抗体等电点，抗体与DEAE结合，用离子强度逐渐增强的缓冲液洗脱。蛋白A、蛋白G柱纯化抗体免疫亲和层析：从多克隆血清中纯化特异性抗体方法,免疫亲和层析法：（1）用抗原免疫亲和柱纯化：对多克隆血清，纯化特异性抗体唯一方法（2）用抗Ig免疫亲和柱纯化抗体：分离大鼠单克隆抗体,八、抗体的保存,血清、组织或培养上清、腹水保存：0.02%NaN3;分装保存纯化抗体保存：PH值调