抗原特异性的分子基础课件

第二章 抗原特异性的分子基础,一、抗原的概念二、抗原的分类三、抗原决定簇四、抗原结构的免疫化学,ICA-WYS,ICA-WYS,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2008,for his discovery of human papilloma（乳头瘤） viruses causing cervical cancer,1/2 of the prizeGERMANY,ICA-WYS,for their discovery of human immunodeficiency virus,1/4 of the prize FRANCE,ICA-WYS,什么是抗原（ antigen,Ag ） ？ 抗原如何分类？,ICA-WYS,问题,一、抗原的概念,抗原（antigen,Ag）概念是一类能刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答 ，并能与相应免疫应答产物在体内或体外发生特异性结合的物质免疫应答 (immune response) 免疫细胞对抗原分子的识别、活化、分化和效应过程,ICA-WYS,ICA-WYS,免疫原性（immunogenicity，抗原性）指抗原能刺激机体产生免疫应答，即产生抗体或致敏淋巴细胞的能力 反应原性 (immunoreactivity，免疫反应性）指抗原与相应免疫效应物质（抗体和致敏淋巴细胞）在体内或体外发生特异性反应的特性,ICA-WYS,ICA-WYS,10,免疫系统,抗原,抗体或致敏淋巴细胞,体内外特异性结合（免疫反应性）,免疫原性,ICA-WYS,既有免疫原性又有免疫反应性的抗原称为免疫原 （immunogen）,ICA-WYS,6,ICA-WYS,30,二 、抗原的分类,完全抗原 (complete antigen) 具有免疫原性和反应原性的抗原 半抗原 (hapten) 有反应原性，无免疫原性,ICA-WYS,ICA-WYS,30,半抗原(Hapten),具有免疫反应性 , 没有免疫原性的小分子物质,小分子,免疫应答 （immune response）,+,载体 carrier,半抗原+载体=完全抗原,载体(carrier)：赋予半抗原免疫原性的大分子物质,什么是抗原的特异性 ？ 决定抗原特异性的物质基础 ？,ICA-WYS,问题,抗原的特异性（antigen specificity),指抗原诱导机体产生特异性免疫应答并与免疫应答产物发生专一结合的特性,决定抗原特异性的物质基础？,ICA-WYS,决定抗原特异性的分子结构基础抗原表位(epitope)亦称为抗原决定簇（antigenic determinant, AD),ICA-WYS,三、抗原决定簇（表位）,抗原分子表面上一小部分具有化学活性的区域注意：抗原决定簇, 而非 整个抗原决定抗原的 特异性,ICA-WYS,意义 AD是被免疫细胞识别的靶结构，是免疫反应具有特异性的物质基础 AD大小、数目、性质、构型和构象决定着抗原的特异性,ICA-WYS,43,ICA-WYS,抗原决定簇分子大小 受抗体抗原结合部位大小限制1个蛋白质或多肽分子的AD含57个氨基酸残基1个多糖AD含57个葡萄糖残基,ICA-WYS,(一) 抗原决定簇对抗原特异性的影响,ICA-WYS,抗原决定簇位点分布抗原决定簇的位点分布对抗原特异性具有决定性意义,ICA-WYS,ICA-WYS,Sela等用多聚-DL-Ala和聚-L-Lys合成的多肽研究,图2-3 3种合成的叉链多聚氨基酸,ICA-WYS,AD外露分子表面,AD处于分子内侧,残基侧链间距离扩大,ICA-WYS,抗原免疫原性必要条件AD外露在分子表面(与抗体结合的只是抗原分子表面的AD )BSA含18个AD，暴露在分子表面与抗体特异性结合的只有6个。BSA酶解后，内部AD暴露出来，成为新生的 AD，可引起免疫反应,ICA-WYS,ICA-WYS,不同化学基团决定抗原抗体反应专一性Landsteiner用马血清白蛋白分别偶联苯胺类物质组成偶氮蛋白质。然后用所制偶氮蛋白质作抗原分别免疫家兔得到相应抗血清这些抗血清只能与相应抗原起反应说明不同化学基团决定抗原抗体反应的专一性,ICA-WYS,化学组成和性质,ICA-WYS,*,蛋白质中Tyr残基,偶氮苯磺酸蛋白质（抗原）,ICA-WYS,ICA-WYS,表2-1 不同化学基团对抗原特异性的影响,ICA-WYS,ICA-WYS,构型与构象 AD特异性与抗原分子上化学基团空间构型与有关氨基苯甲酸邻、间、对位异构物分别与同种蛋白偶联后，经分别免疫动物得3种抗体，它们只能与相应抗原发生反应AD的特异性与抗原光学构型有关左旋和右旋酒石酸分别与蛋白质偶联后，经免疫动物获得的抗体，只能与相应的左旋或右旋酒石酸发生特异反应。,ICA-WYS,ICA-WYS,表2-2 化学基团位置对抗原特异性的影响,抗体 半抗原（抗半抗原-载体 苯胺 邻氨基 间氨基 对氨基 免疫血清） 苯甲酸 苯甲酸 苯甲酸 抗载体-苯胺 + 抗载体-邻氨基苯甲酸 + 抗载体-间氨基苯甲酸 + 抗载体-对氨基苯甲酸 +,ICA-WYS,ICA-WYS,AD特异性与其构象有关 Sela 合成2种有不同构象的三肽聚合物：TAG-L：Tyr-Ala-Glu 三肽连在多聚Ala和多聚Lys叉链骨架上（无规则螺旋结构）(TAG)n：-螺旋构象的Tyr-Ala-Glu聚合物这两种多聚物分别免疫家兔所产生的抗体，在免疫学上无交叉反应,ICA-WYS,ICA-WYS,分子量7.5x104无规则螺旋结构多聚物,(Tyr-Ala-Glu)n,分子量1.0x105 螺旋构象聚合物,ICA-WYS,ICA-WYS,TAG-L抗原性取决于氨基酸序列，称序列决定簇 (sequential determinant) (TAG)n 抗原性取决于分子构象，称构象决定簇(conformational determinant)溶菌酶分子5个AD，3个是构象AD 改变AD氨基酸序列或破坏蛋白质构象，其专一性也随之改变,ICA-WYS,ICA-WYS,ICA-WYS,1.表位预测方法适于已知一级结构的蛋白质或多肽抗原预测 (1)亲水性方案(Hydrophilicity)蛋白抗原各氨基酸残基分为亲水和疏水残基两类疏水性残基一般埋在蛋白内部, 亲水性残基位于表面,亲水部位与抗原表位有密切联系,（二）蛋白质抗原表位分析方法,ICA-WYS,ICA-WYS,(2)抗原性方案(Antigenicity)抗原性刻度（Welling）各氨基酸用出现在抗原区频率描述, 此频率除以各氨基酸在所有蛋白质中的频率就可推出此刻度值疏水性氨基酸残基对抗原表位形成亦有贡献缺点:所用数据库有限,并且连续位点内的残基被认为是同等重要,ICA-WYS,ICA-WYS,(3)二级结构预测方案(Secondary structure) 转角为凸出结构,多出现在蛋白质抗原表面, 利于与抗体嵌合, 较可能成为抗原表位螺旋、片层结构规则不易形变, 较难嵌合抗体,一般不作为抗原表位预测成功率均不超过65%。Cohen方法对转角的预测正确率很高, 对于已知折叠类型的蛋白质(类, 类,/类) 正确率高达95%,ICA-WYS,ICA-WYS,2. 化学“切割”法或酶法 化学法或酶“切割”抗原, 分离抗原肽段, 研究其与不同McAb的作用, 确定抗原表位该法对蛋白质一级结构不作要求, 测定结果只能是抗原的线性表位,ICA-WYS,ICA-WYS,水解抗原-抗体复合物直接确定线性及构象性抗原表位方法, 又称蛋白质足迹分析( Protein footprinting) 理论依据:抗原-抗体复合物结合部位能抵抗蛋白酶水解采用质谱技术已成功确定细胞色素C , 胃泌素释放肽(GRP) , 脂碱性磷酸酶( PLAP) 等抗原表位Lemmel C, Stevanovi S. The use of HPLC-MS in T-cell epitope identification. Methods 29 (2003) 248 259,ICA-WYS,抗原结合价（antigenic valence ）,能和抗体分子结合的AD数目。半抗原为一价，天然抗原一般是大分子，由多种、多个AD组成，是多价抗原，可和多个抗体分子结合,ICA-WYS,抗原结合价（抗原价）指能与抗体分子结合的AD总数分子量10万：2个抗原价分子量40万：1012个抗原价一个含100个氨基酸的球型蛋白可能只有几个表面AD，因蛋白质空间折叠使大部分AD埋藏于分子内部,ICA-WYS,ICA-WYS,交叉反应Ag除与相应Ab发生特异性反应外，有时还可与其它Ab或Ag发生反应，称为交叉反应（cross reaction）因两种AD在化学结构上有部分相似肺炎荚膜多糖3型(S3)与8型 (S8)均含有纤维二糖醛酸残基结构，有一定相似性，故与马抗S3血清或马抗S8血清相遇时，两者均出现一定程度的交叉反应,ICA-WYS,ICA-WYS,肺炎荚膜多糖S3 型与S8型的结构式：,ICA-WYS,S3,S8,纤维二糖醛酸残基,纤维二糖醛酸残基,纤维二糖醛酸残基,葡萄糖半乳糖残基,ICA-WYS,30,四、抗原结构的免疫化学,（一）蛋白质抗原鲸肌红蛋白结构 1条153个氨基酸残基多肽链+1个血红素辅基 8个螺旋区（-螺旋占75%） 肽链转弯处形成无规卷曲（-螺旋不能转弯）AD处于肽链第16 21、5662、9499、113 119与146151位氨基酸残基的各位点上,ICA-WYS,ICA-WYS,图2-4 肌红蛋白的构象,ICA-WYS,F8,E7,A,B,C,D,E,F,G,H,ICA-WYS,图2-5 鲸肌红蛋白的结构示意图,ICA-WYS,1621,5662,9499,113119,146151,ICA-WYS,ICA-WYS,表2-2 鲸肌红蛋白抗原决定簇位点的一级结构,决定簇位点 氨基酸残基及位置 残基数,15 16 21 22 1 (Ala)-Lys-Val-Glu-Ala-Asp-Val-(Ala) 6或7 56 622 Lys-Ala-Ser-Glu-Asp-Leu-Lys 7 94 99 3 Ala-Thr-Lys-His-Lys-Ile 6 113 119 4 His-Val-Leu-His-Ser-Arg-His 7 145 146 151 5 (Lys)-Tyr-Lys-Glu-Leu-Gly-Tyr 6或7,表2-4 鲸肌红蛋白抗原决定簇位点的一级结构决定簇位点 氨基酸残基及位置 残基数 15 16 21 22 1 (Ala)-Lys-Val-Glu-Ala-Asp-Val-(Ala) 6或7 56 62 2 Lys-Ala-Ser-Glu-Asp-Leu-Lys 7 94 99 3 Ala-Thr-Lys-His-Lys-Ile 6 113 119 4 His-Val-Leu-His-Ser-Arg-His 7 145 146 151 5 (Lys)-Tyr-Lys-Glu-Leu-Gly-Tyr 6或7,ICA-WYS,AD位点分布 分子表面突出部位肽链转角处或末端、两个-螺旋区域之间大小与抗体分子抗原结合部位大小相符AD中氨基酸类型分析 Lys (AD1、2、3、5)、 Arg(4)、Glu (1、2、5)、Asp (1、2)、His (3、4)，均有极性基团与抗体结合，极性基团发挥抗原活性作用？,ICA-WYS,ICA-WYS,（二）多糖抗原,AD: 糖链非还原性端高度分支比直链多糖有较多ADKabat 用抗原性细菌多糖测抗体分子抗原结合部位大小 葡聚糖（dextran）和果聚糖（levan） 作探针,ICA-WYS,ICA-WYS,方法用葡聚糖和抗葡聚糖血清反应，由葡糖单位形成的二糖、三糖七糖等进行沉淀抑制反应，以测定抗体分子抗原结合部位大小可溶性Ag与相应Ab特异结合，在二者比例合适、并有一定浓度电解质存在时，可形成不溶性免疫复合物(IC)沉淀当抗原过量时，形成IC分子小，会发生解离,ICA-WYS,ICA-WYS,抑制剂浓度,抑制百分率,图2-5 葡聚糖、抗葡聚糖与低聚糖间的沉淀抑制反应 注：3为丙糖，4为丁糖，5为戊糖，6为己糖,ICA-WYS,生物标志物（biomarker）定义：能反映致病因素或毒物从暴露到效应过程各个环节性质的特异性生物分子如DNA加合物、蛋白质加合物等用生物标志物作为环境污染物暴露及毒性效应评价、预警，是当前研究热点,ICA-WYS,参考文献：余建新，吴采樱。生物标志物用于污染物的快速检测及毒性评价。分析化学，2002，30（1）：107113,ICA-WYS,常见肿瘤标志物,甲胎蛋白 - AFP癌胚抗原 - CEA卵巢癌相关抗原 CA125乳腺癌相关抗原 CA15-3癌症相关抗原 CA72-4癌症相关抗原 CA50前列腺癌特异抗原 PSA,ICA-WYS,癌胚抗原（ carcinoembryonic antigen; CEA） 广谱性肿瘤标志物对大肠癌、乳腺癌和肺癌疗效判断、病情发展、监测和预后估计是一个较好的肿瘤标志物 CEA is a widely distributed tumour marker. Although it is expressed in high proportions on a variety of human tumours, notably of the colon but also of the breast and lung, studies also reveal the presence of CEA in normal tissues.,ICA-WYS,正常成人血液CEA很难检出70-90%结肠腺癌患者CEA高度阳性，胃癌（60-90）、胰腺癌（70-80）、小肠腺癌（60-83）、肺癌（56-80）、肝癌（62-75）、乳腺癌（40-68）、泌尿系癌肿（31-46） CEA含量与肿瘤大小、有无转移存在一定关系，发生肝转移时，CEA升高尤为明显,ICA-WYS,术前或治疗前CEA浓度能预示肿瘤状态、存活期及有无手术指征等术前CEA浓度低，说明病期早，肿瘤转移、复发可能越小，其生存时间越长；疗效观察手术完全切除者，术后6周CEA回复正常；术后有残留或微转移者，可见下降，但不恢复正常；无法切除者，一般呈持续上升CEA浓度随治疗而下降，说明有效；若经治疗其浓度不变，甚至上升，则须更换治疗方案,ICA-WYS,结构糖蛋白，分子量约20万。不同肿瘤提取CEA, 抗原性相似，所含唾液酸及糖组分含量不一定相同，有多个抗原表位 A highly glycosylated cell surface protein of molecular mass about 180,000. The primary structure：the mature CEA (starting at Lys) consists of 668 amino acids, with the first 643 being extracellular.,ICA-WYS,The extracellular region consists of seven domains, each having sequence similarity with immunoglobulin (Ig) domains, thus CEA is a member of the Ig superfamily . We report the prediction for each of the seven extracellulat domains based on multiple sequence alignments , and a knowledge-based approach for fragment fitting. P. A. Bates, J. Luo, M.J.E. Sternberg, FEBS LETTERS, 1992, 301(2):207-214,ICA-WYS,Fig. 5. A ribbon diagram of the first three domains of CEA showing the postulated packing arrangemcnt. The complete molecule due to rotation and translation of the A and B repeats, would be rod-like in appearance.,ICA-WYS,Fig. 6. Diagrammatic sketch of