乙型肝炎基因治疗

1,乙型肝炎的基因治疗,张涵,演讲者：吴润秋,2,海量PPT模板免费下载,乙型肝炎的现状,全球约有3. 5亿乙肝病毒携带者,我国约1. 3亿,其中1 /4为慢性乙型肝炎,易发展为肝硬化、肝癌。目前主要依靠a-干扰素和拉米夫定治疗,干扰素有效率低,对母婴传播者更低,而后者对细胞内cDNA无影响,不能清除病毒。基因治疗是指将外源基因通过某种途径导入细胞而发挥治疗作用,是极具潜力的抗乙肝病毒治疗策略。,3,4,易水寒江雪敬奉,RNA干扰技术,RNAi (RNA interference) 是指有序列特异性且对特定靶基因有沉默作用的一段dsRNA。它能通过siRNAs (small interfering RNAs) 用来关闭特定的基因表达。 RNAi技术：用一定的方法将小干扰RNA ( siRNA ) 导入细胞, 可特异性地抑制各种外源性和内源性的致病基因, 从而达到治疗疾病的目的。,5,易水寒江雪敬奉,机制,在细胞中导入 dsRNA ,切割酶 Dicer (由核酸内切酶和解旋酶等组成) 将 dsRNA 剪切为小干扰RNA(small inter2fering RNA ,siRNA) ,siRNA 与酶蛋白结合形成 RNA 诱导的沉默复合体( RNA - induced silencing complex ,RISC) ,RISC 根据碱基互补配对原则与靶向 mRNA 结合,在 ATP 参与下利用酶切作用降解 mRNA ,从而导致目的基因表达沉默,而 RISC 则可继续参与下一个 RNAi 作用循环。,6,易水寒江雪敬奉,7,易水寒江雪敬奉,反义核苷酸( antisense obligodeoxy nucleocide ASODN) 是指按碱基互补配对原则与特定靶序列杂交,从而抑制其基因表达的一小段(20bp 左右) 人工合成的核苷酸片断,有精确选择性与高度特异性并且能显著抑制病毒复制。若此核苷酸片段为RNA序列，则技术为反义RNA技术。,反义RNA技术,8,易水寒江雪敬奉,反义DNA技术,按照 Watson-Crcik 碱基配对原则, 设计合成与病毒 mRNA和mRNA前体结合的反义寡聚脱氧核糖核苷酸(antisenseoligode-oxy-nucleotides,asODN，反义DNA),通过阻断翻译或激活RNase H而发挥抗病毒作用。人工合成的asODN易被核酸酶降解,其多价阴离子性难以透过细胞膜。通过适当修饰提可提高其透膜性、稳定性和生物利用度,从而使其作为药用成为可能。,9,可以说反义 DNA 是目前研究最多、应用最广、最有希望发展成为新一代抗病毒剂的基因治疗药物。 迄今已证明asODN可抑制或阻断包括单纯疱疹病毒 (HSV), 罗氏肉瘤病毒 (RSV), 疱疹口膜炎病毒 (VSV), 流感病毒 (IV), 人免疫缺陷病 毒 (HIV), 登革病毒 (DGV), 流行性出血热病毒 (EHFV), 乙型肝炎病毒 (HBV) 和丙型肝炎病毒(HCV) 等多种病毒的复制与表达。,10,易水寒江雪敬奉,核酶(ribozyme)是具有酶催化活性的RNA分子,直接参与前体RNA的加工、剪切与成熟。原生生物、细菌、真菌、植物和动物中都有天然存在的核酶分子。目前发现的核酶包括:一类内含子、二类内含子、RNase P（核糖核苷酸酶）、锤头状、发夹状、斧头状及丁型肝炎病毒(HDV)核酶等,对其二级结构已有所了解,即可在体外合成,也可经表达载体导入后在胞内生成。,核酶技术,11,易水寒江雪敬奉,核酶最早是从四膜虫(一种纤毛原生物)中的核糖体 RNA 前体中发现的。它能催化其他 RNA 分子转变、降解与聚合,使靶 RNA 链在某些特殊部位断裂,重新连接起来,而自身却无消耗,它是一种真正意义上的酶。且核酶在切断 mRNA 后又可以从杂交链上脱落下来,重新结合并切割其他 mRNA ,故其抑制作用明显强于反义RNA。,12,易水寒江雪敬奉,国内外已用核酶体外定点切割了HIV,HAV,HBV 和 DHBV 等病毒区 , 设计合成抗基因寡核苷酸,在 HBV 基因转染的 Hep G2 细胞上证明有一定的抗病毒作用。 HBV 基因组包括四个开放读码框,DNA 在复制过程中首先转录成前基因组 RNA (pgRNA) ,然后再以其为模板逆转录成负链DNA,已有研究针对各基因组设计能切割 mRNA 及 pgRNA 的核酶具有抗乙肝病毒的作用。,13,易水寒江雪敬奉,疫苗,基因疫苗(nucleic acid vaccine)又称核酸疫苗或DNA疫苗指把携带编码外源抗原基因的DNA(通常是质粒)直接导入体内,通过抗原基因表达产物刺激机体产生特异性免疫反应以达到预防和治疗的目的核酸疫苗的种类包括DNA疫苗和RNA疫苗，目前研究最多的是DNA疫苗DNA疫苗主要优点在于能诱导特异性的细胞免疫应答,14,易水寒江雪敬奉,DNA疫苗,DNA 疫苗是20世纪90 年代开发出来的新型疫苗。它可以通过特定的基因表达产物使机体产生细胞免疫和体液免疫。这种在宿主体内表达的抗原的免疫过程与自然免疫相似, 可以提呈天然构象的HbsAg, 无抗原表位的改变; 并且具有长期记忆免疫反应, 不但能用于预防, 且可用于治疗。,15,易水寒江雪敬奉,DNA疫苗,DNA疫苗是将编码外源蛋白的基因表达载体导入机体,以激发机体产生特异性免疫应答,在许多方面比常规疫苗更具优势。如今大规模生产高纯度基因治疗用质粒的技术已初步成熟,通常DNA疫苗含有一个真核启动子推动外源蛋白质基因在体内表达,一个原核复制子使质粒能在大肠杆菌内扩增,积累高拷贝数质粒的大肠杆菌被裂解、纯化,以获取高纯度质粒。,16,易水寒江雪敬奉,作用机制,基因疫苗接种机体后，目的基因的表达产物系内源性抗原,激发体液、细胞免疫机制而达到防治乙型肝炎的目的。DNA 疫苗(质粒) 在注射部位被细胞摄取后通过转录翻译生成蛋白质,蛋白质通过胞内处理后,把信息递呈给类MHC 限制性CD+8 T 细胞,表达类MHC 分子或共刺激分子。,17,易水寒江雪敬奉,摄取质粒的细胞能分泌释放抗原,刺激B 细胞生成抗体。同时抗原被APC 细胞(抗原递呈细胞) 摄取,通过类MHC 分子,递呈给CD+4 T细胞和B 细胞,识别病毒感染的细胞。CTL (细胞毒性T 淋巴细胞) 介导细胞免疫对病毒感染预防起着重要的作用。CTL 能识别细胞表面的病毒蛋白,通过感染细胞的细胞溶解机制和通过细胞因子非细胞溶解机制来完成。,18,易水寒江雪敬奉,乙型肝炎的病原体乙型肝炎病毒(HBV) 属于双链(有部分单链区) DNA 病毒乙型肝炎病毒编码三种抗原: HBsAg、HBeAg、HBcAg, 其中HBsAg在诱导机体产生保护性的免疫应答中起重要作用，因此成为乙肝病毒DNA 疫苗研究首选的靶抗原,19,易水寒江雪敬奉,乙肝疫苗的现状,早期乙肝疫苗是用含HbsAg 的人血浆制备而成，其成本较高，现采用重组基因乙肝疫苗替代。基因疫苗对儿童的免疫效果经过多家研究单位的血清学检测其效果已被肯定，其保护率85%，对儿童时期阻断乙肝病毒的传播起到积极作用。目前国内成人10g重组乙肝疫苗可能剂量偏低，接种后抗体水平并不高，需要提高。,20,易水寒江雪敬奉,胞内抗体是指将所需抗体的编码基因导入细胞，在靶细胞内表达出抗体并与相应HBV抗原结合，抑制病毒的包装和出胞过程，以达到治疗的目的。应用单克隆抗体技术，可不经人体免疫而得到人源化基因抗体。,胞内抗体,2