抗原抗体反应及应用

第七章 抗原抗体反应及应用,第1节 抗体的制备与应用,抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含特异性抗体的血清。多克隆抗体(PAb)：多个抗原决定簇免疫机体所产生的多种抗体的混合物。单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb）：由单一B细胞克隆合成并分泌的一种组成均一的免疫球蛋白分子，简称单抗。,一、抗血清的制备,1、免疫动物 抗原 佐剂 免疫动物 2、抗血清的纯化与保存 采血 纯化与保存 3、抗血清的鉴定 效价 亲和力,抗原的准备,病毒、细菌、蛋白质或半抗原半抗原与载体偶联制备完全抗原佐剂的使用：佐剂与抗原按1：1比例混合乳化 弗氏佐剂,动物的选择,抗原与免疫动物的种属差异越远越好。对蛋白质抗原，大部分动物皆适合，常用的是山羊和家兔；甾体激素免疫多用家兔；酶类免疫多用豚鼠。抗血清量的需要：大动物如马、骡等可获得大量血清（一头成年马反复采血可获得10000ml以上的抗血清）；但有时抗体需要量不多，选用家兔或豚鼠即可。,免疫途径,一般采用多点注射，一只动物注射总数约为810点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，免疫效果较好；亦有肌肉、腹腔、静脉注射途径。腹腔、肌肉、皮内、皮下注射适合使用任何抗原，刺激局部淋巴结发生免疫应答；静脉注射适合可溶性抗原及分散的单细胞悬液，不使用佐剂，免疫应答主要发生在脾脏。,免疫剂量与周期,免疫剂量：抗原用量视抗原种类及动物而异，一般大动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.51mg/只，小动物约0.10.6mg/只。免疫周期：初次免疫后，再经23次以上的加强免疫，一般34周间隔适合大部分动物，小动物1014天，大动物2月左右。,动物采血法,颈动脉放血法：这是最常用的方法，对家兔、山羊等动物皆可采用。心脏采血法：此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动物。此法采血技术应熟练，穿刺不准容易导致动物急性死亡。静脉多次采血法：家兔可用耳中央静脉，山羊可用颈静脉。这种放血法可隔日一次，有时可采集多量血液。,抗血清的纯化与保存,试血、采血：加强免疫后23次，可通过耳静脉或眼球采血，进行抗血清效价测定，当效价达到理想高度，可以心脏直接采血或动脉放血。待血凝后用针筒或吸管吸取血清。抗血清纯化：盐析、层析(离子交换、分子筛、亲和层析)。保存：低温冻存，冻干、加保护剂（叠氮化钠NaN3或BSA）4保存。,抗血清的鉴定,效价鉴定：效价又称滴度（titer），是表达抗血清中特异性抗体相对含量的一个半定量指标，即在一定条件下结合一定量抗原的抗血清的稀释度。亲和力鉴定：亲和力（affinity）指抗血清与相应抗原结合的强度，是描述抗体特异性的重要指标，常用亲和常数K表示。抗体特异性鉴定：常用琼脂双扩散法鉴定抗体特异性。,二、单抗的制备,1、单抗的制备原理2、单抗的制备方法抗原提纯和动物免疫骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备细胞融合 筛选阳性株单克隆抗体的制备和冻存单克隆抗体的纯化,单抗制备的原理,MAb是单一B细胞克隆产生的，其特异性是针对一个抗原决定簇的，它是B细胞克隆的标志。为使B细胞在体外能长期存活，Khler和Milstein于1975年创建了杂交瘤方法。其基本原理是：将分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能长期体外培养但不能分泌抗体的瘤细胞融合，筛选出既能分泌抗体又能长期体外培养的杂交瘤细胞，然后单克隆化，并扩大培养，从而进行单抗生产。,单抗制备的材料,骨髓瘤细胞（经诱变和筛选）：不产生抗体或者产生抗体的某种链但不能分泌次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型B细胞小鼠或大鼠脾脏中分离得到融合剂50%的聚乙二醇(PEG)或电脉冲HAT选择培养基含10%-20%小牛血清和HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷的首字母缩写 )的RPMI1640(一种培养基),单抗制备的技术,抗原提纯与动物免疫骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备细胞融合HAT法筛选杂交瘤细胞阳性细胞的筛选、单克隆化与保存单克隆抗体的制备与纯化,单抗制备技术流程图,三、单抗的医学应用,单克隆抗体的均一性和生物活性单一性，使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下：单克隆抗体具有灵敏度高、特异性好的特点，可用于各类病原体的诊断，这是单克隆抗体应用最多的领域。对肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原进行检测，用于肿瘤的诊断、分型及定位。,检测淋巴细胞的表面标志，用于区分细胞亚群和细胞分化阶段。应用单克隆抗体和免疫学技术，可对机体的多种微量成分进行测定，以便判断健康状态、检出疾病、指导诊断和治疗等。鼠源性单抗作为体外诊断试剂是满意的，但用于人体可能会引起过敏反应甚至危及生命。目前虽然已通过人鼠细胞杂交及人人细胞杂交进行了一些探索，但还不能商品化生产，因此制备人源单克隆抗体是目前亟待解决的问题。,第2节 抗原抗体反应的原理,抗原抗体反应可分为两个阶段：抗原与抗体发生特异性结合，此阶段仅需几秒至几分钟，不出现可见反应。可见反应，此阶段抗原抗体复合物在环境因素的影响下，进一步交联集聚，表现为凝集、沉淀、中和、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。抗原抗体反应原理：抗原抗体间的作用力亲水胶体转化为疏水胶体,抗原抗体间的作用力,抗原和抗体通过非共价键结合，两者间涉及多种弱的分子间作用力：静电引力、范德华力、氢键作用力、疏水作用力等。由于结合是可逆的，结合与解离的强度在一定条件下取决于抗原与抗体的亲和力,抗原抗体间的作用力,抗原抗体间结合力表现为：亲和力（affinity）：单价抗原与抗体间结合力的强度，表现为抗原抗体反应平衡常数；亲合力（avidity）：多价抗原与抗体间结合力的总强度，表现为多个亲和力的加成。,亲水胶体转换为疏水胶体,亲水胶体：抗体和大多数抗原都是蛋白质，蛋白质亲水的氨基羧基周围可形成水化层，再加上同种电荷相斥，就形成了稳定的亲水胶体。疏水胶体：当抗原与抗体结合后，表面电荷减少，水化层变薄；且抗原抗体结合后，与水接触的表面积减少，由亲水胶体转化为疏水胶体。各疏水胶体进一步靠拢，形成可见的抗原抗体复合物沉淀。,抗原抗体反应特点,抗原抗体反应是指抗原与对应抗体在一定条件下特异结合，形成可逆性抗原抗体复合物的过程。此类反应的规律和特点有：,特异性可逆性比例性,特异性,特异性是指任何一种抗原分子，只能与由它刺激所产生的抗体发生反应。因为抗体CDR与抗原决定簇在化学结构和空间构型上呈互补关系。这种高度的特异性在传染病的诊断、防治等医学和生物学领域都已得到了广泛的应用。大多数天然抗原物质的构成复杂，常含有多种抗原决定簇。如果两种不同的抗原物质具有部分相同或类似结构的抗原决定簇，则可与彼此相应的抗血清出现交叉反应（cross reaction）。,可逆性,可逆性是指在一定条件(如低pH、高浓度盐等)下，抗原抗体复合物分子间作用力减弱而导致解离，回复到抗原与抗体的游离状态。抗原抗体反应遵循生物大分子热动力学反应原则，其反应式为：,抗原抗体反应平衡取决于两个因素，一是抗原抗体亲合力大小；二是环境因素对复合物的影响。,比例性,比例性是指多价抗原与抗体反应，只有当二者浓度比例适当时，才形成大的抗原抗体结合物，产生凝集、沉淀等可见反应。把最迅速出现可见反应时的抗原抗体的浓度比或量比，称为抗原抗体反应的等价点（equivalence point），抗原与抗体比例最合适的范围称等价带（equivalencezone）。Marrack提出的网格学说解释了抗原抗体反应比例性的机制。,网格学说,当多价抗原与多价抗体在等价带结合时，相互交叉连接成具有立体结构的网格状复合体，形成肉眼可见的沉淀物。当抗原或抗体过剩时，由于过剩方的结合价得不到饱和，只能形成较小复合物，不能出现可见反应。,第3节 抗原抗体反应的应用,一、免疫沉淀与免疫凝集二、免疫标记三、免疫定位分析四、抗原抗体反映的其他应用,一、免疫沉淀与免疫凝集,溶液中的环状沉淀试验凝胶扩散沉淀电泳条件下的沉淀反应免疫共沉淀免疫凝集,二、免疫标记,免疫标记技术：将已知抗体或抗原标记上易显示的物质（示踪物），通过检测标记物反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。目前有四种方法：放射免疫分析法：以同位素为示踪物，为最灵敏、可靠的免疫标记技术。酶联免疫吸附试验（ELISA）荧光与发光免疫分析亲和标记的免疫分析,标记免疫技术=,灵敏性,特异性,免疫技术+标记技术,酶联免疫吸附试验（ELISA） ( enzyme linked immunosorbent assay),(1) 定义：抗原与抗体吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，抗原与抗体反应后，将固相与液相分离除去游离的抗原或抗体，而结合的抗原或抗体上被标记的酶仍保持活性，催化底物形成有色产物。(2) 测试方法：可目测或用分光光度计比色进行定性或定量检测。,(3) 原理（以间接性ELISA为例）：,首先以已知抗原包被酶标板，吸附一定时间后，洗涤未结合的可溶性抗原成分,在吸附有抗原的酶标板中，加入待测血清，孵育一定时间，使待测血清中的特异性抗体与包被抗原充分反应、结合，之后充分洗涤未与抗原结合的游离抗体成分。,显色,在吸附有抗原抗体复合物的酶标板中，加入针对待测抗体来源种属的酶标二抗。酶标二抗吸附一定时间后，充分洗涤，去除未结合成分。,加入标记酶的相应底物，孵育一定时间后显色(底物被酶催化变为有色产物)。产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析,三、免疫定位分析,1. 免疫荧光定位分