乙型肝炎病毒标志物的检测

实验十二,乙型肝炎病毒标志物的检测,实验目的和要求,1、熟悉ELISA（ enzyme-linked immunosorbent assay ）的原理及操作方法2、掌握乙型病毒标志物的临床意义,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。,（一）基本原理,（一）基本原理,用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。,（二）实验试剂,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。,1、双抗体夹心法,双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。,（三）实验方法,（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。,1、把抗体固定在固相支持物上（96孔板）；2、加入蛋白质样品保温，再洗去未结合的杂蛋白；3、加入第二抗体，第二抗体结合一个供检测用的酶（辣根过氧化物酶）4、洗去未结合第二抗原，酶活测定。,双抗体夹心法测抗原,2、间接法测抗体,间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。,（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。,间接法测抗体,步骤一,将抗原HBsAg吸附于载体表面（厂家已经完成）,步骤二,原理：将待测血清加入，温育，血清中如有HBsAb，则抗原抗体结合操作：阳性血清，阴性血清，待检血清各加1孔，每孔50ul(1滴),步骤三,原理：加入酶复合物， (HBsAg-HRP),酶复合物与表面抗体结合操作：加酶复合物1滴,混匀, 置37温育30分钟倒出液体,洗涤5次，拍干。,步骤四,加入酶的底物，酶与底物反应，显色操作：每孔加显色液A液,B液，各1滴，37温育15分钟，使充分显色。,终止反应：每孔加终止液50l（一滴）肉眼观察或上机比色,步骤五,1、乙肝病毒的形态结构,（四）应用乙肝病毒标志物的检测,大球形颗粒（ Dane颗粒，有感染性的完整颗粒）,HBsAg （外衣壳蛋白）,HBcAg （内衣壳蛋白）,HBV DNA,DNAP,小球形颗粒,过剩的衣壳（ HBsAg）,管形颗粒,2、HBV的抗原组成,表面抗原HBsAg：外衣壳核心抗原HBcAg：内衣壳，仅感染的肝细胞核内 e抗原HBeAg：自肝细胞分泌而存在于血清中,（1）表面抗原（HBsAg）与表面抗体（抗-HBs）,存在于三型颗粒中是HBV感染的主要标志，见于急性、慢性、携带者抗-HBs，保护性抗体（中和抗体），标志着机体对HBV有免疫力，见于恢复期、既往感染者或接种疫苗后,3、HBV的抗原抗体系统,（2）核心抗原（HBcAg）与核心抗体（抗HBc）,内衣壳，仅存在于感染的肝细胞核内，不易在血液中检出抗原性强，刺激机体先产生IgM，后产生IgG，后者可在血清中存在多年抗HBc无中和作用，高效价抗HBc IgM提示病毒在体内复制增殖。,（3）e抗原（HBeAg）与e抗体（抗-HBe）,可溶性蛋白，游离存在于血液中它的消长与DNA聚合酶及Dane颗粒出现的时间一致，为病毒复制和血清有强传染性的标志。抗-HBe有一定保护作用，是传染性低、预后好的征象。,HBsAg: 感染的主要标志抗-HBs：对HBV有免疫力H