器官移植及其免疫学检验2

第十七章器官移植及其免疫学检验,返回总目录,目录,移植(transplantation): 指用自体或异体的正常细胞、组织或器官置换病变的或功能缺损的细胞、组织与器官，以维持和重建机体生理功能的治疗方法。供者（donor）受者（recipient）移植物（graft）移植排斥反应（graft rejection）,移植,移植的类型,目的： 救治末期器官衰竭、恶性血液病、肿瘤以及某些遗传病。 要求： 尽可能让移植物能在受体体内生存或暂存常时间。 问题： 排斥反应。,移植的目的和要求,早期有关器官移植的尝试和研究,有关排斥反应的研究,首次植皮第5天 首次植皮第12天 再次植皮第5天,Alexis Carrel (France) Nobel Prize in Physiology or Medicine 1912从事有关血管缝合以及脏器移植方面的研究,与移植免疫发展有关的诺贝尔获奖者,Peter Brian Medawa（UK） Nobel Prize in Physiology or Medicine 1960 1945年，Medawar提出 移植排斥是免疫反应,与移植免疫发展有关的诺贝尔获奖者,特异性免疫耐受的形成,Jean Dausset(France) Nobel Prize in Physiology or Medicine 1980； 鉴定人白细胞抗原(HLA) 系统,与移植免疫发展有关的诺贝尔获奖者,组织相容性受遗传基因控制；组织相容性基因（MHC）为多态性基因，其所编码的同种异型抗原（主要组织相容性抗原）诱导移植排斥反应；关于MHC基因及其编码分子的研究揭开了免疫应答理论的新篇章。,Gertrude B. Elion (1/3) , George H. Hitchings (1/3) Nobel Prize in Physiology or Medicine 1988Discoveries of important principles for drug treatment -免疫抑制剂的发现,与移植免疫发展有关的诺贝尔获奖者,Joseph E. Murray (1/2) Nobel Prize in Physiology or Medicine 1990Discoveries concerning organ transplantation in the treatment of human disease,与移植免疫发展有关的诺贝尔获奖者,实施第一例人同卵孪生兄弟间的肾移植 如果采用药物抑制免疫系统，在非亲缘关系的人之间进行器官移植是可能的,异种之间的移植无一例外地要失败；同一种系内不相关的个体之间的移植常常要失败；自体移植总是能成功；同种异体的受体对首次移植物排斥时间较长，但再次接受同一供体的移植物，则迅速被排斥；受体与供体间的血缘关系愈近，移植愈可能成功。,移植排斥反应的规律,宿主抗移植物反应(host-versus-graft Reaction, HVGR) ，见于一般器官移植，包括超急性、急性、慢性排斥反应移植物抗宿主反应(hraft-versus-host Reaction, GVHR )，主要发生在骨髓移植和其他免疫细胞移植,第一节 移植排斥反应的类型和机制,一、同种异型移植排斥的分类及效应机制,超急性排斥反应（hyperacute rejection）指移植器官与受者的血管接通后立即或12天内发生的排斥反应 发生时间 移植器官与受者血管接通后数分钟至12天内发生,1.超急性排斥反应,病理变化 血管内凝血缺血、变性和坏死发生机制 以体液免疫为主，受者体内预存供者的抗体 抗ABO血型抗原的抗体 抗HLA抗原的抗体 抗VEC抗原的抗体,急性排斥反应（acute rejection）指在移植后数天至两周左右出现的免疫排斥反应，一旦发生进展迅速 发生时间 移植后数天至2周左右出现，80%90%发生于移植后一个月内,2.急性排斥反应,病理变化 急性体液性排斥反应 血管内皮细胞损伤为主要表现的急性血管炎急性细胞性排斥反应 实质细胞的坏死并伴有大量淋巴细胞、M浸润,发生机制：以细胞免疫为主移植物血管损伤针对血管内皮细胞表面同种异型抗原的IgG抗体补体依赖的细胞毒作用实质细胞损害CD4+Th1介导的迟发型超敏反应CD8+Tc直接杀伤表达同种异型抗原的移植物细胞,慢性排斥反应（chronic rejection）指发生于移植后数周、数月、甚至数年的免疫排斥反应 发生时间 移植后数周、数月、甚至数年发生病理变化 间质纤维化，移植物内血管平滑肌细胞增生，血管硬化,3.慢性排斥反应,发生机制：体液免疫和细胞免疫共同作用（具体尚不完全清楚） 急性排斥反应细胞坏死的延续和结果 炎症性CD4+T细胞/M相关的慢性炎症 非免疫学因素诱发组织器官的退行性变,移植物抗宿主反应（Graft-versus-host reaction，GVHR）是由移植物中的抗原特异性淋巴细胞识别宿主组织抗原而发生的一种排斥反应 发生条件宿主与移植物之间组织相容性不合移植物中含有足够数量的免疫细胞宿主处于免疫无能或免疫功能严重缺陷状态,移植物抗宿主病,4.移植物抗宿主反应,移植物抗宿主病,移植物抗宿主病,GVHR发生情况一旦发生一般难以逆转，导致移植失败，严重损伤患者，甚至死亡 主要见于：骨髓移植（主要）、胸腺移植、脾移 植、新生儿接受大量输血 多数情况下由次要组织相容性抗原引发,MHC(HLA)配型与移植排斥反应,返回章目录,第二节 组织配型及配型方法,引起移植排斥的抗原为移植抗原（transplantation antigen），即组织相容性抗原，是移植排斥的分子基础。 组织相容性（移植）抗原（histocompatibility (transplantation) antigens） : 两个遗传不同的个体之间进行移植（grafted）时，存在于组织或细胞上的决定排斥反应（rejection）的抗原。,主要组织相容性抗原 （major histocompatibility (MHC) antigens）：能够引起急性移植排斥反应的同种异型抗原称为主要组织相容性抗原， 在排斥反应中是最重要的。主要组织相容性复合体 （ MHC complex）：单一染色体上编码MHC抗原的一组基因（ group of genes on a single chromosome encoding the MHC antigens）。,人白细胞抗原 HLA (human leukocyte antigens)：人的MHC 抗原 （MHC antigens of man） 首先上在白细胞表面检测到 ( first detected on leukocytes)。 H-2 抗原 （H-2 antigens）：小鼠的MHC 抗原（ MHC antigens of mouse）。,一、HLA分型,历年发现HLA抗原和基因的情况,HLA命名,注：MLR为混合淋巴细胞反应；GVHD为移植物抗宿主反应；CML为细胞介导的淋巴细胞溶解；Ir为免疫反应。,多态性现象（polymorphism)是指一随机婚配的群体中，染色体同一基因座有两种以上基因型，即可编码二种以上的产物。HLA复合体是迄今已知人体最复杂的基因复合体，有高度的多态性。,（一）多态性,位于一对同源染色体上对应位置的一对基因称为 等位基因（allele）；由于群体中的突变，同一座的基因系列称为复等位基因。HLA复合体的每一座存在为数众多的复等位基因，由于各个座位基因是随机组合的，故人群中的基因型可达108之多。,甲 （6#）,乙 （6#）,A5，A10，B40，B16,复等位基因,一对等位基因同为显性称为共显性。HLA复合体中每一个等位基因均为共显性，从而大大增加了人群中的HLA表型的多样性，达到107数量级。因此除了同卵双生者外，无关个体间HLA型别完全相同的可能性极小。,HLA molecule ：A1， A2， B8，B35,甲,甲,乙,乙,HLA molecule ：A2， A10， B40，B16,共显性表达,HLA的单元型遗传,PCR-RFLP（restriction fragment length polymorphism）PCR-SSO（sequence specific oligonucleotide probes）PCR-SSP（sequence specific primers）PCR-SSCP（single-strand conformation polymorphism ）,（二）HLA DNA分型技术,基本原理：根据HLA核苷酸碱基序列的多态性和已知的DNA序列，设计一系列等位基因型别特异性顺序引物。引物的3-端碱基根据多态性序列与其严格互补。因此，每一型别都具有特定的引物对相对应。通过特定的PCR反应体系扩增各等位基因的型别特异性DNA片段，产生相对应的特异性扩增产物条带。,PCR-SSP分型法,PCR-SSP分型法操作步骤 1基因DNA提取 2引物混合物的组成 3TaqDNA聚合酶 4扩增条件的选择 5电泳 6结果判断,1：阴性对照；2：为DR3；3：为DR11；4：为DR4；5:为DR1；6：为DR12；7：为DR15；8：为DR12；9：为Mark。 图：HLA-DR1、DR15阳性的杂合子电泳图谱,PCR-SSO分型法,PCR 基因片段扩增后利用已知的序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与PCR 产物在一定条件下杂交具有高度的特异性，严格遵循碱基互补的原则。探针可用放射性同位素标记，通过放射自显影的方法检测，也可用非放射性标记如地高辛、生物素、过氧化物酶等进行相应的标记检测。,基本原理,PCR-SSO技术分辨率高，特异性强，可区分只差一个核苷酸的序列，其检出范围宽，是HLA基因分型技术中最好的一种。,方法评价,多荧光微珠免疫分析,是将标记有生物素的序列特异性引物分别扩增HLA -A、B、DRB1等基因座位的特异性片段,扩增产物与事先包被在不同颜色的磁珠上的已知的寡核苷酸探针进行杂交,经冲洗将没有杂交上的DNA洗脱,与探针结合的标记有生物素的DNA 片段与荧光素标记的亲和素结合，多荧光微珠在Luminex100流式细胞仪上进行判读结果。,基本原理,同其他技术相比较，其最独特的优势是可在几秒内同时检测上千个分子, 对HLA多个位点进行低、中、高分辨率的分型。,方法评价,二、红细胞血型抗原,人红细胞血型抗原是重要的组织相容性抗原，移植前应检测供者与受者的血型是否相符，最佳选择是二者血型相同，或至少符合输血原则。输血原则：O型受者只接受O型移植物；A型受者接受A型或O型；B型受者接受B型或O型；AB型受者接受范围较广。Rh抗原应相配。,三、交叉配型,将受者和供者淋巴细胞进行混合培养（mixed lymphocyte culture, MLC），由于淋巴细胞表面富有HLA-I和HLA-II分子，若供、受者HLA抗原差异较大，彼此间将产生较大的刺激，淋巴细胞产生较强的增殖反应，细胞增殖反应的水平与供、受者间组织相容性程度呈负相关。,混合淋巴细胞培养 (体外移植模型),返回章目录,第三节 避免排斥反应的免疫学检验及意义,一、HLA抗原配型,已知移植器官长期存活与供受者HLA抗原密切相关。 器官的质量和免疫抑制剂等主要影响移植器官的短期成活（1年），而组织配型在移植物长期存活中起关键作用。,“骨髓库”构建原理,ABO血型系统也是主要组织相容性抗原。当供者与受者的ABO血型不符时，移植物的血循环重建后会即刻导致严重的排斥反应而使移植失败。 其它红细胞血型抗原系统（如Rh抗原）也能影响移植物的存活时间。mH抗原主要是由Y染色体基因编码的产物，属于次要组织相容性抗原。,二、其它组织相容抗原配型,三、新的组织配型策略,1. 器官移植的供者和受者如重要的HLA基因座的等位基因完全匹配，还有其它的HLA基因座的等位基因未匹配，并不能因此完全避免排斥反应。,2. 构成同种异体移植免疫排斥反应的靶分子的氨基 酸残基由数量较少的HLA亚型决定，其有可能成为组织器官移植配型的新的生物学标志。 3. 不同器官、不同部位、不同个体HLA抗原在排斥反应中所起的作用都不一样。,四、受者体内抗HLA抗体筛选,如果受者体内有抗供者的抗体，说明受者的免疫系统已被供者致敏，有产生超急性排斥反应的可能 ，典型的方法是采用微量淋巴细胞毒试验。,根据细胞死亡的百分比判断抗原抗体反应。曙红染色，在相差倒置显微镜下：活细胞镜下明亮，死细胞呈深暗色。应用荧光法，在荧光相差倒置显微镜下：活细胞镜下呈绿色，死细胞呈红色，目前国际上通用NIH方法计分。,结果判断,NIH计分标准,NIH计分示意图,将已知抗原的淋巴细胞与患者血清及补体孵育，判断患者HLA抗体的特异性。,特定细胞群反应抗体,（pannel reaction antibody,PRA）,原理,1.PRA阳性（10%）患者存活率明显低于10%患者，肾移植前一定要做交叉配型。 6.对于患者所具有的HLA抗体，应避免用相应抗原的供者器官。 7.通常移植后两周，患者血清可产生HLA抗体。,临床意义,移植前必须做HLA配型：血清学或DNA。骨髓、肾移植对HLA配型较严格，心、肝等则不然。经产妇、多次输血或移植失败者定期检查HLA抗体，每月一次。术后两周内每日监测。,器官骨髓移植检查项目的选择和应用,返回章目录,第四节 移植后的免疫监测,淋巴细胞亚群的百分比和功能测定 杀伤细胞活性测定 免疫分子水平测定,用单克隆抗体免疫荧光法或流式细胞仪测定细胞及其亚群。淋巴细胞转化试验测定细胞的功能状态。,（一） 淋巴细胞亚群的百分比和功能测定,方法,在急性排斥的临床症状出现前15天，细胞总数和CD4/CD8比值升高，一般认为当比值大于1.2时，预示急性排斥即将发生,意义,取供者淋巴细胞灭活后作为刺激细胞，分离患者淋巴细胞作反应细胞，将两种细胞混合直接做单向混合淋巴细胞培养，测得的结果实际是特异性淋巴细胞转化试验，是Tc细胞和NK细胞共同作用的结果，进行动态监测的意义更大。,（二） 杀伤细胞活性测定,原理,包括血清中细胞因子、抗体、补体、可溶性HLA分子水平，细胞表面粘附分子、细胞因子受体表达等。,（三） 免疫分子水平测定,血清抗体的检测,细胞因子测定,其它指标,包括抗供者HLA抗体和血型抗体检测； 抗供者HLA抗体采用补体依赖微量淋巴细胞毒 试验测定； 血型抗体采用定量凝集试验完成。,血清抗体检测,TNF-、IL-1、IL-4、IL-6、IFN-等细胞因子水平在排斥反应早期均有升高；急性排斥时IL-2R的血清含量升高；环孢崐霉素A肾毒性所致的肾功能减退时血清肌酐值增高，而IL-2R明显降低 。,细胞因子测定,血清补体水平在排斥反应早期升高，后期下降； 溶菌酶活性升高； C反应蛋白增高。,返回章目录,其它指标,移植成功的关键标准是移植物能基本代替原有器官或组织的功能，从而恢复人体的正常处理状态； 移植成功与否有4个决定因素：器官保存、外科技术、移植物选择和免疫抑制。,第五节 移植的结局和对策,移植抗原检测与配型免疫抑制剂的使用移植耐受的诱导,排斥反应的防治措施,HLA的检测：基因检测 预存抗体检测 交叉配型,移植抗原检测与配型,药物：CsA、Fk506 单克隆抗体：抗CD3单抗,免疫抑制剂的使用,体液免疫水平检测细胞免疫水平检测补体水平的检测急性时相反应物质的检测免疫抑制剂体内药物浓度检测的临床意义,排斥反应的免疫检测,T细胞计数、自身淋巴细胞转化 CD4+/CD8+比值、sIL-2R,非特异性免疫监测指标,特异性免疫监测指标,MLR、CTL、ADCC 微细穿刺病理活检,去除移植物中的过路细胞； 血浆置换术去除受者针对血型抗原的抗体； 受者脾脏切除或放射线照射或免疫抑制剂。,移植物和受者预处理,糖皮质激素、环孢素A（cyclosporin A，CsA）、环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）、FK506和细胞毒性药物等免疫抑制药。 生物制剂：ALG、ATG、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗TCR等。,受者免疫抑制状态的建立与维持,免疫耐受诱导和建立,异卵双生小牛（血型镶嵌现象）,人工诱导免疫耐受实验,猪-人类移植组织和器官的最佳来源,异种移植,异种移植排斥反应类型,超急性排斥反应 迟发型异种排斥反应 慢性异种排斥反应,超急性排斥反应（HAR in xenotransplantation） HAR是异种移植的首要障碍，是人体内一些天然抗体（natural antibody）所介导的。,超急性排斥反应,这些天然抗体识别猪组织细胞表面的异种抗原（xenoantigen），尤其是表达于血管内皮细胞表面的半 乳糖成分 a-1,3-半乳糖苷 (Gala-1,3Gal)。天然抗体与血管内皮细胞结合后激活补体，手术后几分钟至数小时之内就可导致移植器官血管栓塞、坏死。,迟发型异种排斥反应（delayed xenograft rejection，DXR） 局部出现单核细胞和NK细胞浸润与活化，移植物在数天后被排斥。 异种移植物诱导抗体产生，造成补体依赖的细胞毒作用。,迟发型异种排斥反应,慢性异种排斥反应(Chronic xenograft rejection,CXR)供者MHC及其它异种抗原被宿主T细胞间接识别。反应强烈，不易被免疫抑制剂控制。,慢性异种