乙型肝炎标志物检测及质量控制

1,乙肝血清标志物检测及质量控制,关秀茹哈尔滨医科大学附属第一医院检验科 E-mail: Tel2,主要内容,乙型肝炎病毒标志物检测质量控制,室间质量评价（EQA）,室内质量控制（IQC）,3,Dane particle,小球形颗粒,管状和线状颗粒,HBV ParticlesElectron micrograph,Hepatitis B Virus,4,HBV为DNA病毒，球形颗粒，结构包括外壳蛋白（HBsAg，前S1、前S2）和核心颗粒（HBeAg，HBcAg，DNA聚合酶）。,乙型肝炎病毒标志物检测,5,Geographic Distribution of Chronic HBV Infection,全球约有20亿人曾感染过乙肝其中3.5亿人为慢性HBV感染者每年约有100万人死于HBV感染所致得肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。,6,Hepatitis B Virus,Sources: WHO/CSR/LYO/2002:Hepatitis B CDC,1992年流行病学调查结果我国HBV感染率为：57.6%HBsAg携带者：9.75%, 1.2亿我国慢性乙肝病人：2000万,采取措施乙型肝炎疫苗是最有效的防止HBV感染的方式,2006年流行病学调查我国1-59岁人群HBsAg携带率为7.18%， 5岁以下儿童的HBsAg仅为0.96%。,7,人群HBsAg携带率下降,8,血清标志物检测,经典乙肝“两对半”乙肝表面抗原(HBsAg)：最早出现在血液中的病毒抗原乙肝表面抗体（抗HBs）：中和或保护抗体乙肝e抗原（HBeAg）：第二个出现在血液中的病毒抗原乙肝e抗体（抗HBe）乙肝核心抗体（抗HBc、抗HBcIgM）：最早出现在血液中的抗体（IgM）,乙肝病毒前S1、S2抗原及抗体乙肝病毒大蛋白,9,10,HBsAg的发现,1964年Blumberg（39岁）用琼脂扩散法（immunodiffusion, ID），从1名澳大利亚土著输血患者血清中发现一种特殊抗原（Bull NY Acad Med 1964;40: 377-386）1967年Blumberg（42岁）报告，从Down综合征、白血病和肝炎患者血清中也发现该抗原（Ann Int Med 1967;66: 924-931）,11,HBsAg的发现,1970年 Blumberg（45岁）报告澳大利亚抗原是肝炎病毒1972年正式命名为HBsAg1976年荣获诺贝尔生理学和医学奖（51岁）2011年逝世，享年86岁,Baruch Blumberg,12,HBV感染后绝大多数感染者外周血中可出现HBsAg，含 量在5ng600g/ml之间。最低含量为0.2 ng/ml以下， 高者可达2000g/ml以上。 HBV的前S/S基因编码HBsAg，构成病毒外膜，根据所 带亚型决定簇的不同分为adw、adr、ayw和ayr。我国绝 大多数地区以adr为主，adw次之 。 HBsAg不仅存在于血液中，而且还存在于许多体液和 分泌物中，如唾液、尿液、乳汁、精液等。,乙肝病毒表面抗原（ HBsAg ）,13,鉴别乙型肝炎与其他病毒性肝炎,病毒性肝炎,HBsAg阴性,HBsAg阳性,其他病毒性肝炎,乙型肝炎,乙肝病毒表面抗原的应用,14,鉴别急性与慢性HBV感染,急性乙型肝炎感染（6个月）,16,HBsAg 检测方法进展,琼脂扩散 反向血凝 时间分辨 对流免疫电泳 放射免疫 酶联免疫 或化学发光,17,HBV自然感染史,18,感染乙肝病毒2-11周后血清开始出现HBsAg，之后出现转氨酶异常和临床症状。（1）HBsAg定性检测阳性：见于急性乙肝患者，慢性乙肝患者，无症状乙肝病毒携带者。,HBsAg的临床意义,19,（2） HBsAg定量检测-老指标新意义 参考值：0-0.05IU/mL 临床意义：可作为HBV携带者乙肝病毒复制的参考指标评价拉美呋定的治疗效果监测应用-干扰素治疗病人的乙肝病毒复制确定肝移植病人免疫球蛋白的使用剂量对患者的应答情况进行预测对接受治疗患者的免疫控制（ HBsAg 转阴）结局进行预测。,20,HBsAg定量检测的临床应用-作为HBV携带者乙肝病毒复制的参考指标,HBeAg 是反映病毒复制的指标, 并且HBeAg转阴通常是预示着HBV DNA水平降低到低于105 copies/ml的标志。然而，一部分HBeAg阴性但是HBV DNA仍然保持较高的滴度(106copies/ml)。HBsAg and HBV DNA 水平有较高的显著性相关.作为一种替代检测，HBsAg的定量检测能够准确地预测HBV的复制。HBsAg高于15000IU/ml可能反应HBV DNA处于较高水平的滴度以及HBeAg处于阳性的状态。如果HBsAg 滴度在1600 至15000IU/ml之间，应该考虑检测HBV DNA。,21,HBsAg定量检测的临床应用-评价拉美呋定的治疗效果,当出现YMDD 突变出现的时候, 通常在生化指标出现异常之前血清HBsAg 浓度和HBV DNA滴度增加。在YMDD突变出现之后，血清 HBV DNA 持续升高, 然而HBsAg的增加是瞬时的, 与ALT的升高相似。(A)在大部分病人中, 血清HBsAg的增加是由于HBVDNA的增加. 然而在某些病人中, 血清HBsAg在HBV DNA增加几个月之前便增加。 (B). 除了监测HBV DNA 水平之外，同时监测血清HBsAg浓度或许能够有利于较早地发现在拉美呋定治疗中的耐药突变。,22,HBsAg定量检测的临床应用-监测应用a-干扰素治疗病人的乙肝病毒复制,量化评估乙肝病毒表面抗原的出现是大有应用前景的，因为该方法是一简单而廉价的方法，可以用于慢性乙型肝炎患者接受干扰素治疗时监测病毒复制的指标。,23,乙肝病人肝移植后使用乙肝免疫球蛋白可以有效地防止再感染的发生。HBsAg降低至1IU/ml以下时，HBsAg和HBIG的呈高度相关（r=0.97,r=1.00）；Anti-HBs升高至大于1000IU/L时， HBsAg和HBIG的呈高度相关（r=0.94,r=1.00）。在移植期间，用于降低HBsAg 增加anti-HBs 的HBIG 的剂量取决于HBsAg的水平而不是HBV DNA 水平。,HBsAg定量检测的临床应用-确定肝移植病人免疫球蛋白的使用剂量,24,对患者的应答情况进行预测,2010年，Sonneveld等研究结果表明： HBeAg（+）患者，用干扰素治疗12周时HBsAg未下降的患者中97%为无应答，且最终无一例获得HBsAg转阴。因此认为治疗12周时HBsAg无下降的患者获得持续病毒应答（SVR）的几率非常小，同时不大有HBsAg转阴的机会，所以临床医生可以根据12周时患者的HBsAg降低情况来决定是否继续接受治疗。,25,对患者的应答情况进行预测,干扰素治疗HBeAg（+） 乙肝患者12周时HBsAg水平是今后HBsAg清除的预测指标治疗12周时HBsAg无下降（20000IU/ML）可预测低应答，可作为停药规则。治疗过程中HBsAg无下降，复发率高。治疗12周时HBsAg明显下降（20000IU/ML）可预测高应答，治疗效果较好，继续用药，完成疗程。,26,对患者的应答情况进行预测,干扰素治疗HBeAg（-） 慢性乙肝患者，12周时无HBsAg下降、HBV-DNA下降2Log cp/mL，可作为停药指标治疗12周时HBsAg下降（ 1500IU/mL ）， HBV-DNA下降1Log（1年内下降），3年时HBsAg消失在25%。缓慢下降HBsAg1Log（1年内下降），3年时HBsAg消失在1.4%。稳定，无变化，3年时HBsAg消失在0%。HBsAg消失患者的HBsAg 呈快速和持续下降。,28,对接受治疗患者的免疫控制（ HBsAg 转阴）结局进行预测,2009年Heathcote等研究结果表明，与所有患者的总体水平相比，发生HBsAg转阴患者的HBsAg水平在治疗期间明显下降，而HBV DNA水平则无明显差异。这说明通过HBsAg定量检测提前预测患者获得免疫清除的可能性，从而提高患者的治疗信心和疗效。Wursthorn等在2010年研究结果显示，口服抗病毒治疗中，HBsAg的水平下降尤其是迅速下降与HBsAg清除密切相关，认为HBsAg清除的患者可以考虑停止治疗。,29,HBsAg清除和血清学转换是理想的治疗终点,持久免疫控制是达到HBsAg清除的重要条件,HBsAg下降HBVDNA抑制,治疗中,持久免疫控制,HBsAg清除,减少肝硬化和肝癌，提高存活率,30,HBsAg清除和血清学转换是理想的治疗终点,HBsAg血清转换可作为持久免疫控制指标,即使使用高敏度试剂测不到HBVDNA并不表示无循环的HBV和/或HBV感染已清除,时点评价病毒载量可作为抗病毒治疗有效和持续应答,HBsAg定量检测可确定宿主免疫系统是否已有效控制HBV感染,31,HBsAg检测在个体化卫生保健中的作用,32,HBsAg测定中可能存在的挑战：假阴性,HBsAg含量低于所用方法的测定下限之下。如感染的“窗口期”、急性期后或恢复期、自限性感染末期的携带者等编码HBsAg的HBV-S基因的突变HCV/HDV重叠感染对HBV复制和/或HBsAg的表达的抑制作用 测定方法所用抗体对HBV不同基因型检测敏感性的不同钩状效应（HOOK EFFECT）,33,HBsAg的变异所致的不常见的HBV标志物模式或不一致的结果,单独抗HBc阳性。HBsAg阴性但HBeAg阳性。HBsAg（HBeAg）和抗HBs（大多为100PEI U/mL，则建议调整治疗方案。,43,HBV 变异的检测,HBV 突变的原因乙肝病毒的复制是通过用逆转录酶（RT）由RNA到DNA，由于逆转录酶缺乏必要的校正能力。逃避机体清除病毒的压力。,44,HBsAg突变,定义：HBsAg的突变是乙肝病毒的表面抗原蛋白的决定簇的结构改变，这个结构的改变是由病毒核酸和氨基酸序列出现的替代，删除或插入性的变化所引起。位置: 报道中最常见的变异位于“a”决定簇即有双环结构的乙肝病毒S基因的124147a.a.报道中最常见的变异株是 Gly（甘氨酸）145Arg（精氨酸）。原理 :“a”决定簇具有很强的抗原性，所以是中和抗体的诱导位和作用靶位，在这个区域的发生变异可以逃逸宿主产生的中和性抗体的中和作用。,45,HBsAg逃逸突变的影响,逃避宿主的中和作用，导致HBV突破性感染。在有HBsAg变异株检测能力的测试中发现HBsAg和anti-HBs共存。在无HBsAg变异株检测能力的测试中出现假阴性结果，可能在临床诊断和血液筛查中造成严重后果。乙肝疫苗接种加速了HBsAg的突变，乙肝的免疫治疗和抗病毒治疗也会导致HBsAg的突变。,46,常见乙肝病毒标志物检测模式,47,常见乙肝病毒标志物检测模式,48,结果的报告与解释,结果解释的责任属于临床实验室，应根据所检测的人群解释结果。临床解释的责任属于临床医生，其应根据临床信息解释结果。临床实验室与临床医生的对话对适当利用实验室数据非常重要。,49,乙肝“两对半”结果解释的困扰,HBsAg和抗-HBs同时出现HBeAg和抗-HBe同时出现HBeAg阳性但HBsAg阴性只有抗-HBe和抗-HBc阳性单项抗-HBe阳性单项抗-HBc阳性,50,单独HBsAg阳性,51,HBsAg和抗-HBs同时阳性,52,单独HBcAb阳性,53,HBeAg和HBeAb同时阳性,54,单独HBeAg阳性,55,单独HBeAb阳性,56,如何正确地理解和应用乙肝血清学标志物检测结果：临床实验室方面,应在充分阅读理解试剂盒说明书的基础上，建立检测报告的标准操作程序（SOP）。与相应的临床科室医生充分交流沟通，使得临床医生能充分理解结果的报告方式及内在含义，以及在标本采集、患者用药上可能对检验结果的影响，从而尽可能避免标本收集环节可能给结果带来的影响。可能的话，在结果报告单上加上对结果的综合解释。,57,如何正确地理解和应用乙肝血清学标志物检测结果：临床医生方面,根据检验目的，正确地开出检验申请单。 最重要的是要明确检测乙肝“两对半”的目的！是诊断是否感染？还是抗病毒治疗预后判断？对检验结果不应是固定的静止的去看待，应以动态的纵向的和横向的方式去看。 作为一个特定的HBV感染者，某一次检测乙肝“两对半”，什么样的模式组合都有可能出现。出现某种罕见模式，既可能是由于患者感染后的免疫状态的反映，也可能是标本中的干扰因素所致的假阳性或假阴性，或实验室不可知原因的检测错误。,58,质量控制的目的： 给临床和患者提供准确的检测结果，进而为疾病的诊断提供有利依据。,质量控制,59,质量管理概览,60,质控目的的新理解,规范所有人：主任操作者病人临床厂家很大程度上，质控的目的是为了失控,61,室间质评（比对计划）,62,室间质量评价（实验室间比对）： 使检验结果具有可比性，保证检验结果的准确性。 如参加卫生部临检中心及省临检中心的室间质评。 室内质量控制： 使检验结果具有很好的重复性，决定当日结果能 否发出。,质量控制,63,室间质评： 如参加卫生部临检中心及省临检中心的室间质评。室内质控： 1、原厂质控品 2、第三方质控品：从卫生部临检中心及省临检中心购买；商品化质控品 3、自制：利用试剂盒内的阴阳性对照或患者的血清进行配置,质控品来源,64,定性、半定量与定量项目的质量控制定性试验：报告“阴性-”或者“阳性+”的试验。半定量试验：报告“x+”、“阴性-”或者“滴度”的试验。定量试验：报告定量检测项目的试验。,质量控制,65,常见定性、半定量及定量试验的检测报告方式,定性检测肉眼判读结果，无法（需）读取检测信号大小（强弱），直接报告阴阳性的。如：ENA抗体、金标法项目、免疫印迹法项目。仪器判读连续检测信号，使用Cut-off判断阴阳性的。如：ELISA、发光仪等。半定量检测肉眼或者仪器判读，判别颜色强弱并报告“x+”或报告稀释度的。如：尿干化学、凝集试验。定量检测,66,定性、半定量及定量项目的质控方法,定性检测：直接报告阴阳性的注意“质控品”与“阴阳性对照”的区别。需要阴性和阳性质控各一。最好有弱阳性质控。无法统计质量控制，但须回顾性统计符合率。定性检测：以Cut-off值报告阴阳性结果的。用阴性质控、弱阳性质控（如不可取得，只用阳性质控）来控制。夹心法弱阳性质控的S/CO约为1.5-4，视不同方法而定，如竞争法：S/CO约为0.5-0.9。用“符合度”判断质控情况。用L-J图控制精密度：定性sAg、sAb、eAg CV%15%左右。eAb、cAb CV%20% 定量sAg 、sAb10%,67,定性、半定量及定量项目的质控方法,半定量检测：报告“x+”或稀释度的选择阴性和适中浓度质控品。如2+。1+3+为在控。无法统计质量控制，但须回顾性统计各结果比率。定量检测使用定量质控方法,68,定性项目质控还因注意的几个问题,质控判断和精密度控制分开。推荐用S/CO值建立均值、SD、CV%。因为有些读数值很低的项目是不符合相应统计要求的。如过低值的CV%会很大。加心法使用弱阳性和阳性统计。竞争法用阴性和弱阳性统计。避开极低的S/CO。最好附加极高值质控排除钩状效应。,69,乙肝标志物质量控制,主要包括三个方面：（1）测定前的质量控制；（2）统计学质量控制；（3）质量控制的评价。,70,测定前的质量控制,实验室设施、仪器设备及管理理想的试剂和操作方法 人员培训,71,实验室设施、仪器设备及管理,实验室空间及工作流程的设计实验室环境条件的控制：温湿度控制设备、稳压或不间断电源仪器设备及管理：酶标仪、洗板机、全自动免疫分析仪、加样器等应建立技术档案，并定期维护和校准,72,理想的试剂,试剂的质检(确认) 测定下限(Detection limit) 批内变异(10%)和批间变异(15-20%) “钩状”效应(Hook effect) 变异体的检测能力(HBsAg) 对本室所用室内质控血清检测的一致性,73,理想的操作方法,按照试剂盒说明书操作即可吗?操作中影响测定结果的关键环节写出具有可操作性的SOP,74,人员培训,培训所涉及的范围:仪器设备使用、维护和校准；试剂、方法原理；质量管理体系；相关法律法规、相关领域的新技术、新理念和新进展；实验操作技能等。如何培训：讲座、讨论、自学和参加培训班等。培训的评估：书面考试、实验考核、讨论心得、论文、综述等。对培训者的评估：培训者的背景、资历、在相关领域内的成就、所接受过的相关领域外部培训情况等。,75,统计质控方法,定性免疫测定质控物浓度的选择室内质控物的质检(确认)每块板质控物的数量质控规则Levey-Jennings质控图方法,76,定性免疫测定质控物浓度的选择,可选择S/CO值减去精密度测定中得到的三倍批间CV（通常的ELISA测定批间变异（CV%）在15%左右）与该S/CO值的乘积（意即三倍SD）仍大于1的质控血清作监测重复性的室内质控用 计算公式：S/CO（1-3CV%）=S/CO-3SD S/CO比值可在1.54之间。 同时选择S/CO处于1.01.5左右的质控血清以判断每次测定时试剂盒测定下限的有效性。,77,室内质控物的质检(确认),使用前的质检：检测的S/CO比值是否合适、与前一批质控物的S/CO比值的比较使用中的确认：质控物的稳定性、批与批质控物的一致性,78,每块板质控物的数量及位置,空白2份弱阳性质控23份阴性质控23份阳性质控随机放置于血液标本中间,79,质控规则的表达方式及定义,质控规则的表达方式 质控规则的功能 常用质控规则的符号及定义,80,质控规则的表达方式,通常质控规则以符号AL来表示，其中A为质控测定中超出质量控制限的测定值的个数，L为控制限，通常用均值或均值1-3SD来表示。 当质控测定值超出控制限L时，即可将该批测定判为失控。 常用的13S质控规则，其中1为原式中的A，3s为原式中的L，表示均值3s，其确切的含义为：在质控测定值中，如果有一个测定值超出均值3s范围，即可将该批测定判为失控。,81,质控规则的功能,简单地说就是用于判