吴健民乙肝病毒基因检测和基因型

乙肝检验新进展 乙肝病毒基因检测和基因型,华中科技大学 同济医学院附属协和医院,吴健民,乙型肝炎全球分布,乙肝现状,乙肝病毒携带者占人口10%.全世界共有3亿乙肝携带者、我国乙肝携带者总数高达1.3亿.10%转化为各种慢性肝病，包括有慢性肝炎、肝硬化和肝癌我国慢性肝病人数3000万，肝病死亡人数每年30万,国人感染HBV起始于幼龄期,幼龄感染 成年感染,90%慢性化 10%清除病毒 急性肝炎 女性，我国携带者约10%，这种人虽然没有临床症状, 体检肝功能正常或有轻微损害，有时ALT升高，血中抗-HBS（-），具有一定的传染性, 不应作为供血者。可持续数周、数年这种人将来可能发生慢性活动性肝炎、迁延性肝炎、肝硬化和肝癌值得注意。,抗-HBs ： 阳性表示 既往曾感染过HBV，现已恢复； 接种乙肝疫苗后； 被动性获得抗-HBs抗体,HBeAg： HBeAg阳性表明: 患有乙型肝炎，是病毒复制活跃，传染性强的指标，且HBeAg持续阳性的乙型肝炎，易转变为慢性肝炎, 肝硬化。 HBeAg , HBsAg (+) 的孕妇 所生的新生儿，母婴垂直 传播的机会很高， 达90%值得重视。,抗-HBe： 意味着 HBV部分被清除或抑制，复制减少，传染性降低, 但慢性肝炎, 肝硬化阳性率高 e抗体和e抗原一般不同时存在，e抗原消失，e抗体产生。 e抗体（+）说明患者曾出现过HBeAg 但对e抗体（+）者不可视为HBV复制平息。,抗-HBc IgM ： 是诊断急性乙型肝炎和判断病毒复制活跃的指标，并提示病人血液有强传染性。抗-HBc IgM阳性也可见于慢性活动性肝炎。 抗-HBc IgG ： 高滴度表明机体正感染HBV；而低滴度抗-HBc IgG则是既往感染过HBV的指标，具有流行病学的意义。 (非保护性抗体),乙型肝炎病毒血清标志物的综合评价,(1) (2) (3) (4) (5) 急性或慢性乙型肝炎，高传染性 急性、慢性乙型肝炎或慢性HBsAg携带者 急性乙肝趋向恢复或慢性乙肝，弱传染性 急性HBV感染康复期或有既往感染史，有 免疫力 乙肝恢复期，弱传染性 急性HBV感染“窗口期”， 或既往曾感染 过乙肝 接种HBV疫苗或HBV感染后康复 急性乙肝康复期，开始产生免疫力 无HBV感染,HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe 抗-HBc + + + + + + + + + +-,乙型肝炎病毒前S1(Pre S1)蛋白与抗-前S1抗体 前S1蛋白是HBV外膜蛋白的成分，由108110个氨基酸组成，通常连接在前S2蛋白的氨基末端。前S1蛋白 第2147位氨基酸为肝细胞膜的受体，HBV 可通过这一受体粘附至肝细胞膜上，从而侵入肝细胞。前S1蛋白抗原性较强，可诱生机体产生抗-前S1抗体。 【临床意义】 前S1蛋白阳性提示病毒复制活跃，具有较强的传染性。抗-前S1抗体是HBV的中和抗体，能阻止HBV入侵肝细胞，抗-前S1抗体较早出现提示预后良好。抗-前S1阳性，见于急性乙肝恢复早期，常表示HBV正在或已经被清除，是观察乙肝病情，了解预后及乙肝疫苗接种后是否有效的指标。,前S1蛋白的存在导致免疫细胞的激活引发免疫损害、肝细胞坏死、转氨酶升高、黄疸出现,乙肝病毒前S1蛋白,前S1,HBV DNA： 是HBV感染最直接，最灵敏和最特异的检测指标，且血清中HBV DNA的水平可作为治疗方案与疗效观察的指标。,HBV DNA定量检测,循环数. 扩增子数 (靶序列拷贝数)122438416532664201,048,576301,073,741,824(10亿),目的基因扩增,PCR 和 PCR 的定量问题,高浓度 /高效率高浓度 /低效率低浓度 /高效率N:扩增分子的数量n:扩增循环数,对数期分析,N,n,终点分析,LightCycler的定量概念,标准曲线,未知标本,Crossing Point (Cycles),log (copy number),n,log (F2/F1),n,log (F2/F1),Target,FQ-PCR（ Taqman技术） 荧光化学基础 反应体系中，不仅有两条普通的引物，还有一条荧光标记探针。这条探针的5端和3端分别标记了荧光报告基团（R）和荧光淬灭基团（Q）。当这条探针保持完整时，R基团的荧光信号被Q基团所淬灭；一旦探针被切断，淬灭作用消失，R基团的荧光信号就可以被测定。,开始时,仪器并不能检测到荧光(阈值)。 因Taq聚合酶同时具有5端外切酶的活性，在PCR反应的延伸阶段，Taq酶会把5端的荧光分子切下，使其与3端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器就会检测到荧光信号。每一个循环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加。,双标记探针(FQ-PCR反应的实现),双标记探针:Taqman probes,1. HBV DNA 检测结果与血清标志物的综合评价 与HBsAg检测结果的关系 : 一般来说HBsAg阳性，HBV DNA测定常常阳性。在实践中可能遇到的问题是HBsAg测定结果阴性，而HBV DNA测定阳性, 其原因可能是因为: HBsAg ELISA测定敏感性低，对极低浓度的HBsAg测不出，而PCR具极高的灵敏度，HBV DNA含量即使很低亦可检测出来； 或在HBV感染早期，此时所有乙肝的免疫标志物尚未产生。, 与抗-HBs的关系 : HBV感染恢复期，抗-HBs阳性，血清HBV DNA检测一般为阴性，但少部分亦可为阳性，特别是肝组织HBV DNA测定阳性率仍很高，说明HBV还没有从肝脏中完全清除掉。只有HBV DNA测定阴性才是病毒消除的明确指标。 与HBeAg，抗-HBe和抗-HBc的关系: HBeAg阳性，HBV DNA检测几乎全为阳性； HBeAg阴性而抗-HBe和抗-HBc阳性者，仅表明病毒复制减弱，但并未完全消失，血清HBV DNA的阳性率仍可高达 60% 80% 。因此HBV DNA 检测是评价HBV传染性的最可靠方法。,2. 抗病毒药物治疗乙肝的疗效评价 使用定量PCR测定乙肝患者血中HBV DNA的含量在治疗前后的变化，可以判断相应药物的疗效，从而确定有效的治疗方案。 3. 筛查献血员，防止乙肝病毒输血后感染。,HBV基因分型及其意义,杭州博赛基因诊断技术有限公司,HBV感染后常引起感染的慢性化，引起慢性肝炎，肝硬化。许多肝细胞癌患者也常常伴有HBV感染。不同的HBV亚型及亚型内特异部位的核苷酸位点的变异可能与感染的慢性化及感染后病情的转归有一定的关系。,亚型突变与病变程度关系,乙型肝炎病毒,血清型（九个）,基因型（A-H型）,乙肝的临床特征,HBV亚型的划分,血清型目前认为HBsAg 含有5种不同的抗原表位，分别为a、d、y、w、r，其中“a” 属于特异性抗原决定簇，d/y及 w/r是2对亚决定簇，d与y，w与r 一般不同时出现，根据HBsAg的血清学分析，目前已知有 9 种亚型, 主要的有adr、adw、 ayw、 ayr等4种。各亚型的分布有明显的地区性。,1 排斥决定簇 HBsAg主蛋白还携带两对相互排斥的亚型决定簇d/y （122-134 aa指令d/y决定簇）和w/r （159-160 aa指令w/r决定簇）。2 四个主要亚型组成4个主要亚型：adw、adr、ayw和ayr。,四个主要亚型,ayw：地中海沿岸、非洲、中近东、俄罗斯、印度；adr：分布于我国，朝鲜、日本、远东地区；adw：由东非、北欧、美洲、及澳洲等地。ayr： 亚型极少见。,流行病学意义,HBV基因分型,根据全基因核苷酸序列异源性或者基因区核苷酸序列异源性，将不同病毒株分为不同的基因型。,乙型肝炎病毒基因分型的方法 全基因序列比对分型法 限制性片段长度多态性分析法（RFLP） HBV基因分型芯片,基因扫描图,限制性片段长度多态性分析法（RFLP）,HBV的基因型和分布,根据全基因核苷酸序列异源性或者基因区核苷酸序列异源性，将不同病毒株分为不同的基因型，迄今为止，可以分为个基因型， 即、和型。,HBV 的异质性 基因型,基因型 * 地理分布 A 北欧、西欧、美国、非洲 B 中国、印度尼西亚、越南 C 中国、越南、朝鲜、日本 D 地中海区、中东、印度 E 西非 F 美国（印地安拿人）、波利尼西亚 G 欧洲、美国 H 尼加拉瓜、墨西哥 * 根据 HBV 全序列中核苷酸差异 8% Chu CJ et al. Hepatology 2002; 35(5):1274,17.2,81.4,53,32,12.2,84.7,0%,20%,40%,60%,80%,100%,中国 (上海）,台湾,日本,其他基因型,HBV基因型 C,HBV基因型 B,亚洲部分地区的基因型分布,国内部分地区基因型分布,100%80%60%40%20%,沈阳 北京 广州 上海,HBV基因型的临床意义,近年来研究发现, HBV基因型具有如下意义与HBV标志物清除的关系与病毒致病性的关系与乙型肝炎的病程及转归的关系与药物敏感性的关系与HBV血清型比较,HBV 基因型具有更加重要的意义。,HBV基因型和HBeAg的清除的关系,临床资料显示，HBeAg 的清除可能与基因型有关。与基因型相比，基因型有更高的 HBeAg 阳性率，分别为与。基因型的自发性 HBeAg 清除要比（基因型）早，并且在 HBeAg 清除后，肝脏生化指标持续正常。,50%,5%,55%,24%,0,10,20,30,40,50,60,1830,3160,年龄 （岁）,Frequency（）,基因型B,基因型C,P0.01,Kao, Intervirology 2003;46:400407,不同HBV基因型患者中HBeAg阳性率比例与年龄的关系.,HBV 基因型与病毒复制及标志物表达的关系,* Log genome equivalents/ml,ETSURO ORITO, et al Hepatology 2001,HBV病人肝硬化的累积可能性,Journal of Medical Virology 70:350354 (2003),HBV基因型和点突变,基础核心启动子区（Basic Core promoter）双点突变 （A1762T / G1764A）,常见的点突变：,前核心启动子区G 1896A 导致提前出现终止密码子, HBeAg的消失,HBV 基因型对点突变和alpha干扰素治疗的影响,Chun Tao Wai, et al Hepatology 2002:1425-1430,HBV基因型和HBsAg 血清清除率,Hepatology. 2004 Jun;39(6):1694-701.,HBV 基因型与疾病类型的关系,日本学者Shiina分析了1 744 例HBsAg 阳性者的基因型与肝功能异常的关系后发现,与B 基因型相比, C 基因型的肝功能异常更为常见。,组织学炎症活动分数相关性的研究结果表明C型组织学病变更重。,表明C 基因型引起的临床表现及组织学损伤更严重。,Journal of Clinical Microbiology, 2003, 12771279,KAO等在进一步对67 例无症状HBV携带, 103 例慢性肝炎, 32 例肝硬化, 20 例肝细胞癌患者进行基因分型研究中发现,各组均以B/ C 型为主, C基因型所占比例按上述顺序逐渐增大, 而B 基因型的比例逐渐减小;与B 基因型比较, C 基因型在肝硬化患者中比例较高,而B 基因型在50 岁以下, 特别是35 岁以下的肝细胞癌患者比例较高。,HBV基因型和肝细胞癌的关系,Kao JH, J Gastroenterol Hepatol 2002;17:643650.,不同基因型HBV患者中HCC发生率和年龄的关系,HBV基因型和HCC的存活时间,Journal of Medical Virology 65:257-265 (2001),HBV基因型与抗病毒药物敏感性的关系,不同基因型HBV感染对干扰素治疗反应的差别,Kao 对 58 例慢性乙型肝炎患者给予干扰素治疗48周, B基因型 和 C基因型的完全应答率(血清ALT 恢复正常,HBeAg 消失,HBV DNA 转阴) 分别为41和15 , 说明干扰素对B基因型治疗效果较好。,Kao JH, et al. J Hepatol 2000;33:9981002.,HBV基因型的临床意义,拉米呋定的疗效与HBV基因型的关系,KAO 对 31例 HBeAg 阳性乙型肝炎患者使用拉米呋定治疗, 发现 B基因型和 C基因型患者的HBeAg/ HBeAb 转换率分别为 23 %和 11 % , B 基因型优于C 基因型。,Intervirology 2003;46:373376,注：最近文献倾向于没有两者没有差异。,型HBV感染者发生肝癌后，对栓塞治疗的反应优于基因型，栓塞治疗后预后较好； 而基因型患者发生肝癌后，在栓塞治疗后仍继续发展，最终死于肝衰竭。,HBV基因型和HCC栓塞治疗的关系,Tsubota A, et al. J Med Virol. 2001;65(2):257-65.,总 结,特征 基因型 B型 C型流行病学调查 低 高HBeAg阳性率 低 高 HBeAg自然清除时间 短 长 HBV DNA 载量 低 高致病性 轻 重HCC发生率 低（低年龄组高） 高（高年龄组高）干扰素治疗完全应答率 高 低抗病毒治疗效果 好 差肝癌手术治疗预后 好 差 癌栓栓塞治疗效果 好 差,乙型肝炎病毒B和C基因型荧光PCR检测,原理：采用Taqman荧光PCR技术，在一个PCR扩增系统中，加入两条基因型特异性荧光探针，一条探针检测 HBV C基因型，FAM荧光素作为报告基团；另一条探针检测 B 基因型，VIC荧光素作为报告基团。监测荧光定量PCR仪上双通道实验数据，可以非常简便判断HBV 基因型。,TaqMan探针检测,5,3,5,5,3,5,R,Q,5,3,5,5,3,5,TaqMan Probe,R,Q,VIC标记,FAM标记,TaqMan Probe,乙型肝炎病毒基因分型与血清学分型的关系： 乙肝病毒的同一血清型可分布在不同的基因型之中，尤其以adw血清型的核酸序列变异程度最大，如adw可分布在A、B、C三型之中。西藏 的HBV基因型为C，并且至少存在两个亚型。占优势的是C/D混合型，血清型为ayw，另一种为基因型C，血清型为adw。台湾 大部分HBV血清型adw的基因型为B，所有血清型adr的基因型为C。生于大陆的患者感染血清型adr/基因型C的比例较高。,特点：1.准确性好:与核酸序列测定分型比较，两者结果吻合率100%。2.操作简单、耗时短、结果判断直观明确 :试剂在荧光PCR检测仪上进行扩增和分型分析，根据双通道荧光增长曲线或Ct值即可直接判断HBV基因型。不需进行电泳、核酸纯化、紫外灯观测、测序反应等步骤。只需0.51.2小时即可完成PCR过程，有利于提高报告速度。3.有效防污染: PCR反应和分析在完全封闭的系统内进行，有效防范PCR产物污染，提高检测结果的可靠性。,拉米呋定治疗后YMDD基因型变异 (Y I DD 和 YVDD),用拉米夫定治疗后,病毒的DNA聚合酶基因易发生突变，即 P基因区的YMDD变异， (YMDD变成YVDD或YI DD)， 拉米夫定失去了结合位点,因而产生耐药性。治疗一年时的基因突变率为1216，治疗二年时的基因突变率为4260。所以在临床上发现，发生病毒变异后，常表现为停药后反跳。因此,在治疗期间应进行YMDD变异的监测,以了解拉米夫定的耐药状况。,拉米夫定治疗1年变异发生率,地域研究者发生率(%)亚洲Lai et al16美国/欧洲Schiff et al27欧洲Heathcote et al31美国Dienstag et al32欧洲Tassopoulos et al *27, 包括纯变异型和混合变异型* HBeAg阴性，HBeAb 阳性病人 (包括推定的前-C区突变者),YMDD变异YMDD (酪氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸)YVDD (酪氨酸、结氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸)YI DD (酪氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸),拉米夫定对野生型HBV的抑制,核苷类似物,拉米夫定,ss (-) DNA,抑制,HBV 聚合酶 (野生型),高亲和力,M,D,Y,D,Y = 酪氨酸M = 蛋氨酸D = 天门冬氨酸,拉米夫定和 YMDD 变异株HBV,Y = 酪氨酸V = 缬氨酸D = 天门冬氨酸 I =异亮氨酸,在细胞培养体系中YMDD变异株复制水平显著低于野生株 （Melegari et al， Hepatology 1998; Allen et al, Hepatology 1998）YMDD 变异株 （YVDD and YIDD）与核苷类似物的结合能力显著下降 (Chayama et al，Hepatology1998; Back et al，EMBO J，1996),5,3,5,5,3,Primer,Y M 552 D DC A T A T G G A T G A T,野生型YMDD,5,3,5,5,3,5,Y I 552 D DC A T G T G G A T G A T,5,3,5,5,3,5,Y V 552 D DC A T A T T G A T G A T,变异型Y I D