考马氏亮蓝法测定豌豆中蛋白质含量

实验八实验八 豌豆中蛋白质含量的测定豌豆中蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝考马斯亮蓝 G 250G 250 法法 一一 实验目的实验目的 1 学会用考马斯亮蓝 G 250 法测定蛋白质含量 2 学会自己独立的设计实验 二二 实验原理实验原理 考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合 这种结合具有高度的敏感性 考马斯亮 蓝 G 250 的磷酸溶液呈棕红色 最大吸收峰在 465nm 当它与蛋白质结合形成复合物时 呈蓝色其最大吸收峰改为 595nm 考马斯亮蓝 G 250 复合物的高消光效应导致了蛋白 质定量测定的高敏感度 在一定范围内 考马斯亮蓝 G 250 复合物呈色后 在 595nm 下吸光度与蛋白质含 量呈线性关系 故可以用于蛋白质浓度的测定 三三 实验器材实验器材 旋涡混合器 试管 吸管 722 型分光光度计 容量瓶 电子分析天平等 四四 实验试剂实验试剂 1 9 NaCL 溶液 2 标准蛋白母液 牛血清白蛋白 0 1mg ml 准备称取牛血清白蛋白 0 2g 用 0 9 NaCl 溶液溶解并稀释至 2000ml 3 染液 考马斯亮蓝 G250 0 01 称取 0 1g 考马斯亮蓝 G250 溶于 50ml95 乙醇中 再加入 100ml 浓磷酸 后加蒸馏水定容到 1000ml 以上试剂均为国产或进口分析纯 4 标准液 取牛血清白蛋白 0 1mg ml 溶液 加入 0 9 NaCl 稀释至一定浓度 5 样品液 精密称量 5 0g 研磨的豌豆干粉末 加入 0 9 NaCl 定容至 50ml 备用 五五 实验方法实验方法 一 标准曲线的制备 1 取 6 支干净试管 按下表进行编号并加入试剂 2 混匀 室温静置 3min 以第 1 管为空白 于波长 595nm 处比色 读取吸光度 以 吸光度为纵坐标 名标准液浓度 ug ml 作为横坐标作图得标准曲线 试剂 管 号 1 空白 23456 标准蛋白液 ml H2O ml 蛋白质浓度 g ml 0 1 0 0 0 2 0 9 0 02 0 4 0 8 0 04 0 6 0 7 0 06 0 8 8 0 08 1 0 0 4 1 0 二 样品的测定 1 样液的制备样液的制备 取制备好的大豆组织样液 1 0ml 加入 0 9 NaCl 定容至 250ml 另取一支干净试管 加入样液 1 0ml 及考马斯亮蓝染液 4 0ml 混匀 室温静置 3min 于波长 595nm 处比色 读取吸光度 由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含 量 注意 2 含量的测定含量的测定 经计算豌豆的 0 0547mg ml 及蛋白质的 68 375 六六 注意事项注意事项 1 研究表明 NaCl KCl MgCl2 NH4 SO4 乙醇等物质对测定无影响 而大量的去 污剂如 TritonX 100 SDS 等严重干扰测定 少量的去污剂及 Tris 乙酸 2 巯基 乙醇 蔗糖 甘油 EDTA 有少量干扰 可很容易地通过用适当的溶液对照而消除 同时注意 比色应在显色 2min 1h 内完成 如果测定很严格 可以在试剂加入后的 5 20min 内测定吸光度 因为在这段时间内颜色最稳定 2 测定那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质 有一定误差 因为不同的蛋 白质与染料结合量是不同的 故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白 质 3 待测溶液中蛋白质浓度不可过高或过低 应控制在 100 800ug ml 为宜 七七 思考题思考题 1 Bradford 法测定蛋白质含量的原理是什么 应如何克服不利因素对测定的影响 答答 Bradford 法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的 考马斯亮蓝是一种有机染 料 在游离状态下呈红色 在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸 特别是精氨酸 和 芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色 其最大吸收波长从 465 nm 变为 595 nm 蛋白质 在 1 1 000 g 范围内 蛋白质 色素结合物在 595 nm 波长下的吸光度与蛋白质含 量成正比 故可用于蛋白 质的定量测定 可以提高药品的纯度 设置对照 提高实验者的操作水平等来消除干扰 提高实验的精 确性和可信度 2 为什么标准蛋白必须用凯氏定氮法测定纯度 答答 凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法 是测定试样中总有机氮最 准确和最简单的方法之一 被国际国内作为法定的标准检验方法 其适用范围广泛 测定结果准确 重现性好 具有有准确 快速 简便 低耗 稳定的优点 估在实验前 必须标定标准蛋白的纯度 以确保实验的准确 八 参考文献八 参考文献 1 胡志辉 种子蛋白质组分的综合实验设计 江汉大学学报 自然科学版 第 38 卷第 2 期 2010 年 6 月 2 董洁 郭力维等 中药水提取液中蛋白质含量测定研究 现代中药研究与实践 2009 年第 22 卷第 2 期 3 郭颖那 孙卫 蛋白质含量测定方法比较 河北化工 2008 年 04 期第 31 卷第 4 期 4 郭玉珍 陈庆富 染料结合法测定荞麦种子蛋白质含量的研究 广西植物 Guihaia27 6 952 957 5 食黄婉玉等 考马斯亮蓝法测定果汁中蛋白质的含量品与发酵工业 2009 35 5 160 163 6 郭敏亮 姜涌明 考马斯亮蓝显色液组分对蛋白质测定的影响 生物化学与生 物物理进展 1996 23 6 558 561 附 原始数据 试剂 管 号 1 空白 23456 标准蛋白液 ml H2O m