药理药效研究动物模型GIST

胃肠道间质瘤(GIST) Gastrointestinal Stromal Tumors,温州医学院附属第一医院 病理科 杨开颜,回顾历史,自二十世纪四十年代有相关文献记载以来，发生在胃肠道间叶来源的梭形细胞肿瘤一般都被认识是平滑肌瘤或平滑肌肉瘤,1960年，法国学者Matin首先详细描述了6例发生于胃，具有上皮样特殊形态特征的平滑肌肿瘤,命名为平滑肌母细胞瘤/恶性平滑肌母细胞瘤1969年,WHO将其改称为上皮样平滑肌(肉)瘤,1983年，Mazur和Clark研究发现这类肿瘤缺乏平滑肌细胞和雪旺细胞的超微结构和免疫表型的特征，用更一般的名称“间质瘤”（“stromal tumor”）来命名这些分化方向难以明确的肿瘤，即胃肠道间质瘤（基质瘤）（gastrointestinal stromal tumor，GIST）,1986年，Walker和Drorak研究了3例类似病例的临床病理、免疫组化和超微结构，命名为胃肠道自主神经瘤（gastrointestinal autonomic nerve tumor，GANT）,Newman等（1991）运用免疫组化研究GIST的分化（“组织发生”），提出可分化真正肌源性（平滑肌）、神经性、双向分化和“裸（细胞）”表型四型,Erlandson等（1996）、纪小龙、虞积跃（2000）、廖晓耘等（2000）提议将该肿瘤报告为GIST，平滑肌瘤型；GIST，神经鞘瘤型广义的GIST,Mikhael等（1994）、Miettinen等（1995）证实CD34抗原免疫组化标记可将GIST与真正平滑肌瘤和雪旺瘤分开但一些雪旺瘤和平滑肌肿瘤也可表达CD34，难以区别,上世纪末，对GIST存在两种观点所有胃肠道的间叶源性肿瘤都放在GIST的总标题下，不考虑或至多附带注明免疫表型的差异严格地排除真正平滑肌瘤和雪旺瘤的狭义GIST,Maeda等（1992）和Hulzlnga等（1995）证实肠道Cajal间质细胞（interstitial cells of Cajal ICC，肠肌丛中的起博细胞）和肠道起搏点激活需要c-kit基因的参与（GIST细胞和ICC具有相似的超微结构，都表达KIT受体酪氨酸激酶）,GIST最重要的生物学特征是KIT基因突变和KIT蛋白产物（CD117）表达,2001年，Lee等对10例以往依据超微结构诊断的GANT再研究，证实其形态学、免疫表型和分子遗传学特征与GIST相同，故认为GANT是具有神经分泌颗粒的GIST变型,已澄清的问题 GIST是一种独立的肿瘤，不同于真正的平滑肌瘤和雪旺瘤 不应混淆胃肠道间叶源性肿瘤（gastrointestinal mesenchymal tumor，GIMT）与GIST两个不同的概念,GIST的定义,胃肠道间质瘤是一种免疫表型上表达KIT蛋白（CD117）、遗传上存在频发性c-kit基因突变、组织学上以富于梭形细胞、上皮样细胞、偶或多形性细胞呈束状或弥漫性排列为特征的胃肠道间叶源性肿瘤,发病率,GIST的发病率约为1-2/10万人占胃恶性肿瘤的2.2% 小肠恶性肿瘤的13.9% 结直肠恶性肿瘤的0.1%,美国临床上检测到新病例从原来估计的300-500例/年已上升到5000-6000例/年 我院估计15-20例/年,临床特点,性别和年龄部位临床表现,性别和年龄,临床表现,肿瘤小，通常无症状。常在体检、X线、胃镜检查或其它手术是偶尔发现肿瘤大（大于5cm），可出现症状，通常为非特异性，与部位有关食管：吞咽困难胃：不适、上消化道溃疡、出血,小肠：不适、腹块、梗阻或出血结直肠：腰痛、便血或穿孔恶性肿瘤可有体重减轻、发热、偶有腹腔、网膜播散和肝转移症状，淋巴结转移几率很小,病理学,大体形态 组织形态 免疫表型 超微结构,胃肠道间质肿瘤,电子胃镜观察,粘膜下,肌壁间,浆膜外,肠管,恶性胃肠道间质肿瘤,腹腔播散,大体形态,肿瘤大小不一，境界清楚，但无包膜肿瘤大多位于肌壁间（66%），少数位于浆膜层（26%），可附于胃肠的外表面、或位于粘膜下（8%），可向腔内突起呈息肉状,良性肿瘤通常2cm，结节状，质坚实，切面灰白色，均一恶性肿瘤通常5cm，可浸润周围组织或粘连，粘膜溃疡形成，质较软，切面灰白，灰红或暗褐色，可见出血、坏死和囊性变,组织形态：细胞类型,梭形细胞（以前易诊断为平滑肌肉瘤）70%变型：核端空泡细胞上皮样细胞以及圆形细胞（以前易诊断为平滑肌瘤）30%变型：印戒样细胞因此鉴别诊断非常重要,胃肠道间质肿瘤,梭形细胞 70%,上皮样 15%,70% 胃 15% 小肠 5% 结/直肠 5% 其他部位（食管、 肠系膜、 阑尾、 胆囊）,混合性 - 15%,组织形态：分型,梭形细胞型（上皮样细胞10%）常见（72.1%），尤其见于结直肠上皮样型（上皮样细胞50%）少见（11.0%），尤其于胃混合型（上皮样细胞10-50%）少见（16.9%），尤其见于胃和小肠,308例消化道不同部位GIST细胞学分型,胃与直肠：2=7.03，P0.05小肠与直肠：2=6.5，P0.05胃与小肠：2=2.420，P0.2,平滑肌瘤,平滑肌肉瘤,GIST 低倍镜,GIST 高倍镜,梭形细胞,上皮样细胞,核端空泡,印戒样,消化道不同部位印戒样细胞及核端空泡细胞出现率,印戒样细胞在各部位均可出现，出现率无差异（2=0.203，P0.9）核端空泡细胞则几乎仅出现在胃,组织形态：排列方式,常见：束状 弥漫性生长少见：栅栏状 旋涡状 小巢状 花瓣状或假菊形团样 器官样（副神经节瘤样） 血管外皮瘤样 血管周簇状生长,交叉束状,弥漫片状,常见排列结构,少见排列结构,栅栏状,血管外皮瘤样,花瓣样,片巢状,条索状,器官样,大菊形团样,簇状,消化道不同部位少见排列结构出现率,小肠GIST少见排列结构种类最多,组织形态：间质,胶原粘液样团丝样纤维（Skeinoid fiber，SF）出血、囊性变坏死,黏液变性,团丝样纤维,间质出血及囊变,肿瘤性坏死,已澄清形态学上曾混淆的概念,核端空泡细胞：见于6.8%（5%）GIST中，尤其在胃，认为是平滑肌肿瘤的特点是错误的栅栏状排列：见于18.2%GIST中，认为是神经源性肿瘤的特点不正确，本组12例胃肠道雪旺瘤均无明显栅栏状结构,团丝样纤维（SF）：一种均质红染团块状强嗜伊红色结构，由缠结的胶原纤维组成，见于3.9%（10-20%）GIST中，尤其在小肠，曾认为与神经分化有关，现认为SF与组织发生无关,GIST的免疫表型,GIST中CD117的表达,梭形细胞,上皮样细胞,花瓣状排列,印戒样细胞,栅栏状排列,GIST中CD34的表达,梭形细胞,上皮样细胞,栅栏状排列,印戒样细胞,核端空泡细胞,片巢状排列,GIST中-SMA的表达状况,肿瘤阴性，内对照阳性,局灶,弱,偶尔强,GIST中S-100的阴性,GIST的鉴别诊断,平滑肌瘤、平滑肌肉瘤纤维瘤病 （硬纤维瘤）神经鞘瘤（许旺氏细胞瘤）恶性外周神经鞘瘤炎性肌纤维母细胞瘤恶性黑色素瘤神经内分泌肿瘤恶性间皮瘤血管肉瘤肉瘤样癌,KIT（CD117）的选择,DAKO（A4502）Santa Cruz（sc-168）Novocastra（NCL-CD117）NeoMarker（MS-271）,Miettinen和本组选用Santa Cruz的sc-168多抗，结果满意，且在纤维瘤病中不表达，但近期产品的销价可能降低Dirhofer对8500例肿瘤组织（GIST、精原细胞瘤、黑色素瘤、上皮性肿瘤等）用组织微阵列技术比较不同公司CD117抗体的性能，结果显示DAKO优于Novacaster，Santa Cruz和NeoMarker中度敏感，特异性较低,KIT在GIST中表达的特点,GIST定义为免疫表型KIT+肿瘤，理论上应该阳性率100%阳性反应定位于胞浆、呈弥漫强阳性，尤其细胞膜和Golgi区上皮样GIST有时阳性反应较弱切片中肥大细胞和肠肌丛周围的ICC可作为阳性对照,GIST不表达KIT的原因,抗体的选择取材过少，固定不当，切片干燥时，温度过高或储存时间过长约2%GIST缺乏KIT突变和/或KIT过度表达STI-571(格列卫，信号转导抑制剂)治疗后，偶尔可不再表达KIT,KIT阳性和可能阳性肿瘤,GIST精原细胞瘤肥大细胞瘤黑色素瘤/透明细胞肉瘤ES/PNETKaposi肉瘤/血管肉瘤孤立性纤维瘤隆突性皮纤维肉瘤肌纤维母细胞瘤/纤维瘤病分化良好脂肪肉瘤转移性小细胞癌,一个有争议的问题,诊断GIST是否必须用免疫组化证实KIT阳性许多GIST有显著的临床病理特点，因此，不做IHC可以作出诊断，而且KIT+肿瘤不一定都是GIST目前意见是：为了使GIST诊断标准化和确定病人是否适宜应用STI-571治疗，应做KIT免疫染色,GIST的其它免疫表型特征,Desmin+的GIST极少见，仅2.2%（5%或1-2%），且局灶性见于少数瘤细胞中，常见于上皮样型和食管的GISTCD34除在小肠表达率较低，为42.9%（50%）外，其它部位表达率均较高，食管100%（90%），结直肠96.8%，胃88.5%（85%）-SMA表达常与CD34呈反向关系，及-SMA+/CD34-或-SMA-/CD34+，这在小肠尤为明显,表2-4：224例消化道不同部位免疫组化表达,CD117：2=2.177，P0.2CD34：2=52.50，P0.001-SMA：2=11.47，P0.01,不同部位GIST免疫组化表达谱的变化,阳性率,小肠GIST除高表达KIT外，其它标记物的表达与胃和结直肠有明显差异，即CD34表达低，而-SMA、S-100等表达高，提示不同部位GIST可能由不同表型瘤细胞亚型构成,胃肠道梭形细胞肿瘤的IHC鉴别诊断,*大多数报道CD117阴性,Fletcher CDM，et al. Diagnosis of gastrointestinal stromal tumor：A consensus approach. Histopathology 2002；33：459,胃肠道外间质瘤,腹腔软组织（如网膜、肠系膜和腹膜后）等处可发生与GIST形态学、免疫表型和分子遗传学特征相同的肿瘤，称为胃肠道外间质瘤（extra-gastrointestinal stromal tumor，EGIST），少见，约占GIST的3-4%，以潜在恶性和恶性病例多见，发生在网膜和肠系膜者多于腹膜后者,超微结构,GIST，尤其良性梭形细胞型的超微结构相似于正常ICCMiettinen （2003）认为GIST大多显示流产型平滑肌分化，少数显示自主神经分化，许多肿瘤结合两者特点，提示多能分化,瘤细胞内含丰富线粒体、粗面内质网和滑面内质网、游离核糖体和中间微丝质膜上少量不规则微饮泡质膜密斑样结构质膜外不连续的基板间质内胶原和团丝样纤维,上皮型GIST超微结构,梭形GIST超微结构,过去和现在的诊断术语,已澄清的问题,GIST是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，占所有GIMT的73.0%，其它GIMT包括平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、雪旺瘤、颗粒细胞瘤、脂肪瘤、球瘤、Kaposi肉瘤和血管肉瘤等,仍有争论的问题,肿瘤的生物学行为影响预后的因素肿瘤的组织发生,GIST的生物学行为,至今尚无可靠的指标预测GIST的生物学行为，许多学者推荐依据肿瘤大小和核分裂数来估计转移的危险性，并认为至少在目前使用“良性”GIST这一术语是不明智的有些学者认为尽管偶有例外，依据肿瘤大小、核分裂数和其它一些指标，可以将肿瘤区分为良性、恶性和不确定或低度恶性潜能三类,肿瘤小于5cm，手术完全切除，肿瘤没有破裂等是预后较好的因素肿瘤较大（大于10cm）是影响生存率的因素,确定GIST侵袭行为危险性的推荐方案,作为指导评价GIST生物学行为的肿瘤大小和核分裂数,可能良性肠：最大直径2cm和核分裂数5/50HPF胃：最大直径5cm和核分裂数5/50HPF恶性肠：最大直径5cm或核分裂数5/50HPF胃：最大直径10cm或核分裂数5/50HPF不能确定或低度恶性潜能肠：最大直径2-5cm和核分裂5/50HPF胃：最大直径5-10cm和核分裂数5/50HPF,GIST的形态学从良性、富于细胞、潜在恶性、低度、中度和高度恶性形成连续的生物学行为谱，依据肿瘤大小、生长方式、瘤细胞异型程度、核分裂数和肿瘤性坏死等指标，可对绝大多数GIST生物学行为作出正确诊断,恶性指征,腹膜播散和肝转移肌层、粘膜和/或周围组织浸润脉管浸润或瘤栓形成肿瘤性(凝固性)坏死最大直径10cm核分裂数10/50HPF细胞密集、明显异型瘤细胞围绕血管簇状分布,良性指征,最大直径2cm肿瘤境界清楚细胞欠丰富核分裂不易找见(2/50HPF),增生活性低：Ki-67+细胞10%往往其它手术时偶尔发现位于胃和手术能完全切除者二倍体端粒酶活性低,潜在恶性指征,与周围组织粘连最大直径5cm，但10cm核分裂数10/50HPF,确定GIST危险程度的Fletcher方案,*小肠肿瘤侵袭行为的大小阈值也许比其它部位小12cm,胃肠道间质瘤（GIST）标准病理学诊断报告,临床特征肿瘤来源： 原发 术后复发 转移发病部位： 食管 胃 小肠 结肠 直肠 后腹膜 网膜 肠系膜 肝 其他,需要手术医生在病理送检单上提供的信息,组织病理肿瘤大小_cm （最大直径）核分裂数_/50HPF 组织学类型： 梭形细胞型 上皮样细胞型 混合细胞型,需要手术医生在病理送检单上提供的信息,手术切缘： 阳性 阴性肿瘤性坏死： 有 无肿瘤细胞显著异型： 有 无肿瘤浸润部位： 浆膜 粘膜 脉管 神经 脂肪 其它 无,免疫组化CD117_ CD34_ Dog-1 _ SMA_ desmin_ S-100_ Ki-67_,病理诊断 (部位 + 恶性潜能分级 + 胃肠道间质瘤),预后相关的病理参考指标,肿瘤性坏死肿瘤细胞密集、明显异型肿瘤浸润（血管、肌层、神经、脂肪等）肿瘤细胞围绕血管呈簇状排列Ki-67标记指数,组织发生,GIST瘤细胞形态、免疫表型和KIT表达与胃肠道Cajal间质细胞（ICC）具有相似性：两者均表达胚胎性肌球蛋白活组织培养鼠ICC同时表达KIT和CD34鸟和鼠的发育研究表明ICC和纵行平滑肌束来自共同的前体细胞KIT表达可使前体细胞向ICC分化，KIT信号传导通路受阻可使ICC转变成平滑肌,但是,GIST可以发生在胃肠道外，如网膜、肠系膜和腹膜后GIST的瘤细胞并无ICC功能因此GIST不是起源于ICC，而是可能起自向ICC分化的未定型间充质细胞（uncommitted cell）,GIST的遗传学,GIST表达KIT蛋白是肿瘤发生中的关键步骤，KIT活化可能是肿瘤形成的最早事件之一KIT蛋白属于III型酪氨酸激酶（RTK3），其结构相似于其它几个具有致瘤作用的RTK，包括PDGFRA和B（血小板衍生生长因子）,正常情况下，KIT酪氨酸激酶活性必须与配体（SCF，stem-cell factor）结合形成二聚体后才能激活酶的结构域，称为配体诱导激活。然后，受体自磷酸化，结合底物和衔接蛋白，引起细胞信号级联放大，控制重要的细胞功能，包括增生、粘附、凋亡和分化等,GIST中KIT癌蛋白的致瘤性活化，不需要与配体结合，且常有结构改变KIT激活机制在大多数GIST中是KIT基因本身的致瘤性突变所致，少数可有其它替代机制激活,C-kit受体结构,GIST中KIT基因突变,KIT基因位于4q11-12，突变部位和方式如下：第11外显子：见于50%以上恶性GIST，突变大多数位于密码子550-570之间读框内缺失3-21bp（常见）点突变（较少见）重复或插入（少见）第9外显子，常为双密码子重复突变第13外显子，常为点突变两者仅见于约5%的GIST中,EC：细胞外区；TM：跨膜区；JM：近膜区；TK：酪氨酸激酶区；KI：激酶插入区；AML：急性髓细胞白血病；GIST：胃肠道间质瘤；MAS：肥大细胞瘤；MPD：骨髓增生性疾病；SEM：精原细胞瘤；UP：色素性荨麻疹,KIT基因 PCR扩增及测序,100bp,250bp,225bp,573 574 575 576 577 578 579 580,交界性GIST c-kit基因11号外显子突变，杂合性，序列分析为自580位 点重复前21个核苷酸，即CCA ACA CAA CTT CCT TAT GAT,重复,573 574 575 576 577 578 579 580 581,恶性GIST患者同时伴消化道腺癌者，显示GIST瘤组织有c-kit基因11号外显子突变，杂合性，自581位重复前12个核苷酸；显示腺癌组织无c-kit基因突变,重复,恶性GIST纯合性突变，缺失第557-561共15个核苷酸，经正向和反向测序证实,纯合性缺失,550 551 552 553,恶性GIST c-kit基因11号外显子突变，杂合性，其中一条链自第553位点缺失15个核苷酸，原发瘤组织与复发瘤组织突变方式一致,杂合性缺失,GIST中缺失KIT基因突变的原因,技术原因KIT非突变替代机制,技术原因,石蜡或新鲜冰冻组织抽提DNA突变分析的DNA或RNA模板来自非肿瘤细胞，如肿瘤包膜和肿瘤周围组织，肿瘤内有明显坏死或大量非肿瘤细胞浸润约90%GIST的KIT突变为杂合性，常规检测技术可因混入少量非肿瘤组织而遮盖突变只检测第11外显子而未测第9、13外显子,KIT非突变替代机制,KIT基因可缺乏突变，但肿瘤组织仍存在很高的KIT激酶活性KIT基因非编码区中基因组改变调变KIT细胞信号途径的蛋白表达或功能改变KIT位点基因组扩增导致KIT过表达或KIT途径激活,其它遗传学改变,KIT基因突变是GIST的原发性遗传学异常，随着肿瘤进展可以出现一系列继发性染色体异常，大致顺序为：KIT激活突变14q缺失 22q缺失1p缺失8q获得11p缺失9p缺失17q获得,GIST中18号染色体单体,平滑肌肉瘤X染色体多倍体,FISH检测,GIST的治疗,传统的常规疗法特异性靶向治疗,传统的常规疗法（一）,原发性肿瘤手术治疗：完整切除肿瘤避免肿瘤破裂，术中播散和确保切缘阴性，但MSKCC（2000年）80/200例无转移的原发性GIST完整的切除后5年存活率仅54%（没有必要行淋巴结清扫）辅助放射治疗：疗效远不如四肢软组织肉瘤，且对周围结构（尤其小肠）的毒性作用而使照射剂量（约5100cGy）受限，主要用于胃和直肠肿瘤切缘阳性病例,传统的常规疗法（二）,转移性肿瘤全身化疗：联合化疗的疗效10%（0-15%），Mayo Clinic（1999）报告用氮烯咪胺、丝裂霉素、阿霉素、顺柏和生长因子治疗晚期LMS和GIST，反应率分别为67%和14.8%（疗效差）腹腔播散：手术加米托蒽醌腹腔内化疗肝转移：孤立瘤灶，手术切除；肝动脉栓塞优于全身化疗（总有效率82%）放疗用于巨大肝转移或盆腔固定的疼痛病人,特异性靶向治疗,大多数细胞毒药物通过干扰肿瘤和正常细胞共有的细胞结构（如DNA）而发挥非特异性抗肿瘤作用，选择性差癌症研究认识到肿瘤的发生与癌基因突变、抑癌基因缺失和染色体异常密切相关，寻找直接针对肿瘤特异性细胞和分子遗传学异常的药物，为癌症治疗提供了新的模式,已用于临床的新型靶向治疗药物,美罗华：CD20单克隆抗体，用于治疗CD20+的B细胞淋巴瘤Herceptin：c-erbB-2（neu）单克隆抗体，用于治疗c-erbB-2过度表达的乳腺癌STI-571（Gleevec，imatinib）：小分子选择性蛋白酪氨酸激酶抑制剂，用于CML和GIST治疗,STI-571作用机制,STI-571能选择性阻滞CML中因t（9；22）而形成一种具有不受控制的酪氨酸激酶活性的融合蛋白BCR-ABL，能有效地抑制和杀灭CML细胞进一步研究发现STI-571对BCR-ABL蛋白的抑制不完全特异，也能阻滞与跨膜受体酪氨酸激酶的KIT和PDGFR相关的酶活性，临床前试验证实STI-571能抑制GIST细胞中突变型KIT的激酶活性，导致肿瘤细胞停止生长和发生凋亡,2000年2月芬兰STI-571治疗的第一例GIST,患者表达KIT蛋白，c-kit基因第11外显子突变，各种治疗（多次手术、化疗、抗血管生存治疗）失败后，进行性广泛转移，每天口服STI-571数周后，出现客观的临床反应，18个月以上，MRI显示肿瘤明显缩小，FDG-PET显示肿瘤活性显著降低，4周内多次活检证实，肿瘤大部分被粘液样变性和纤维化代替（随访2年仍在）,Joensuu H，et al. Effect of the tyrosine kinase inhibitor STI-571 in a patient with a metastatic gastrointestinal stromal tumor. New Engl Med 2001；34