乙型肝炎血清学和分子生物学检测技术

乙型肝炎病毒血清学和分子生物学检测技术,临清市疾病预防控制中心,乙肝病毒研究历史,1963年Blumberg 在澳洲土著人血清中发现，简称澳抗。1970年Dane发现HBV病毒颗粒，称Dane颗粒1983年将HBV归为嗜肝病毒科,3,我国HBV感染概况,一般人群HBsAg携带率高达7.18%；现有慢性HBV感染者约9 300万人，占全世界的1/4；其中慢性乙型病毒性肝炎患者超过 2 000万例，占全世界慢性乙肝患者的1/3；15岁以下儿童HBsAg携带率下降显著，1-4岁组仅为0.96%。,3,病毒形态与基因结构,嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)正肝DNA病毒属电镜：3种形态,结构和基因,HBV的基因组长约3.2kb，非闭合的双股环状DNA。短链：为正链，长度是长链的50100长链：为负链，含HBV全部遗传信息有4个开放读码框架： S区：编码HBsAg；前S1抗原、前S2抗原 C区：编码HBcAg和HBeAg； X区：编码HBxAg，并与肝细胞癌变有关 P区：编码DNA多聚酶。其中S区和前S区的基因容易发生变异。,HBV基因组和基因表达产物,3200 bp4 open reading frames7 proteins 大蛋白(preS1-preS2-S) 中蛋白(preS2-S) 小蛋白(HBsAg) 核衣壳(HBcAg) HBeAg 聚合酶 X蛋白,HBV基因型的世界分布,基因型,分布的国家和地区,A,B,C,D,E,F,G,H,西欧、北欧、北美、中非,东南亚、中国、日本,东亚、中国、日本、波利尼西亚等,南欧、地中海、印度,西非,美国土著人、波利尼西亚、中南美,美国、法国,尼加拉瓜、墨西哥、美国,血清型,adw2 ayw1,adw2 ayw1,adw2 adrq+ adrq- ayr,ayw2 ayw3,ayw4,adw4q- adw2 ayw4,adw2,?,机体感染HBV后产生相应的免疫反应，形成多种不同的抗原抗体系统 表面抗原抗体系统 (HBsAg，抗-HBs) e 抗原抗体系统 (HBeAg，抗-HBe) 核心抗原抗体系统 (HBcAg，抗-HBc),HBsAg 最早出现的血清学标志之一 是HBV感染的基本标志 HBsAg阳性见于 乙肝的潜伏期、急性期 慢性乙肝 病毒携带 与HBV感染有关的肝硬化和原发性肝细胞癌,抗-HBs 特异性中和抗体、保护性抗体 抗-HBs阳性可见于 乙型肝炎恢复期，在HBsAg消失后间隔一定时间抗-HBs出现隐性感染的健康人，自身产生了免疫力 注射乙肝疫苗或乙肝高效价免疫球蛋白(HBIG)后，产生的主动或被动免疫,HBeAg 与HBsAg平行出现，较HBsAg消失早 意义 体内HBV复制、传染性强的标志 急性乙型肝炎的辅助诊断 判断预后的指标：HBeAg转阴，表示HBV复制减少或终止，预后好；若HBeAg持续阳性，则预后不良，易转为慢性抗-HBe HBeAg消失后出现无症状HBV携带者及非活动期慢性肝炎患者表示HBV在体内复制减少或终止，传染性减弱或消失,HBcAg 不能从血清中直接检出 Dane颗粒经去垢剂处理HBcAg释放检测抗-HBc 非中和抗体、分IgM和IgG 主要见于慢性感染和既往感染 抗-HBc IgM 通常在出现症状时即可检出，一般持续约6个月，提示HBV 复制，是急性感染的重要指标，也是慢性活动性肝炎的重要标志 抗-HBc IgG 在抗-HBc IgM下降及消失后出现，可伴随感染者终生存在临床机构一般常规检测抗-HBc ，但检测抗-HBc IgM相对较少（乙肝6项）。,抗-HBc IgM 抗-HBc，检测试剂盒也不同，需正确区分,HBsAg,0,4,8,12,16,20,24,28,32,36,52,100,急性HBV感染的血清学变化,暴露后时间,滴度,HBeAg,anti-HBe,Symptoms,HBV DNA,Window Period,IgM anti-HBc,Total anti-HBc,HBsAg,Acute(6 months),HBeAg,Chronic(Years),anti-HBe,0,4,8,12,16,20,24,28,32,36,52,滴度,暴露后时间,慢性HBV感染的血清学变化,HBV感染血清学常见模式,17,HBV感染的实验室检查,乙型肝炎的生物化学检测,主要指标：ALT, AST, 血清白蛋白，球蛋白血清胆红素，碱性磷酸酶其它,18,方法学的发展ELISA：灵敏性高，成本低，适用于普通病人筛查；胶体金免疫层析法(金标法)：简便易行，可用于急诊病人快速检测或无偿献血人员粗筛检测HBsAg；化学发光法定量检测：价格昂贵，可用于HBVMs为临界值的病人的确证；在评价抗病毒治疗的病毒学应答、疗效和判断预后方面有重要意义。新增检测指标PreS1抗原等,19,2. HBV 血清标志物检测,HBV基因型和基因变异研究：必要性主要方法 HBV-DNA病毒载量测定：PCR结合荧光探针技术病毒复制水平最可靠，最直接的证据，与传染性和疾病进展密切相关；主要用于HBV感染的判断，治疗适应症的选择及抗病毒疗效的判断。HBV耐药突变的检测,3. HBV分子生物学检测,病毒基因突变,疾病进展,临床表现,对干扰素应答,耐药变异,生化学改善,HBeAg血清学转换,HBV DNA清除,急性乙型肝炎,慢性乙型肝炎,肝硬化 (LC),肝细胞癌 (HCC),21,HBV基因型/基因亚型,乙肝病毒基因分析技术路线,HBV DNA 提取,PCR扩增相应区段,PCR 产物直接测序,生物信息学分析与数据信息挖掘,血清与资料收集,22,M,W,I,E,D,F,Y,M,S,195,196,I,198,210,158,164,99,121,124,137,138,139,107,149,147,G,D,-S-S-,S-S,S-S,S-S,Loop 1 of “a”determinant,Loop 2 of “a”determinant,145,144,E,R,Alpha helicase, Vaccine escape mutant, Lamivudine resistant mutant,F (苯丙) Y(酪) E (谷) D (天冬) I (异白) M (蛋) W (色) S (丝) M (蛋) I (异白) D (天冬) E (谷) G (甘) R (精),2013中央补助地方项目抗-HBc IgM实验室检测技术,ELISA （最常用，定性）免疫层析法（胶体金或硒标法）发光免疫分析（定量),抗-HBc IgM检测方法：ELISA/发光免疫分析法，本项目采用ELISA方法,ELISA检测实验室配备基本仪器,酶标仪,洗板机,移液器,干式恒温箱,恒温水浴箱,或,-20低温冰箱,普通冰箱,抗-HBcIgM 酶免检测收样：血清标本收样登记表：抗-HBc IgM 1:1000标本检测登记表.doc（县级需检测）慢性乙型肝炎血标本送检表.doc （县级不必检测）样品整理、编号样本保存：标本宜新鲜时检测，若5天内检测，可使用冰箱28保存，超过1周测定，应-20 保存检测项目：抗-HBc IgM检测时限：每月10日前完成上月标本检测检测试剂：省统一购置，分次到省疾控免疫所肝炎实验室领取。试剂储存： 28保存，注意效期结果反馈,抗-HBc IgM 1:1000标本检测登记表 （乙肝监测项目用）. 省（直辖市） 市 县（市、区）试剂生产厂家：,慢性乙型肝炎血标本送检表 （乙肝监测项目用）. 省（直辖市） 市 县（市、区）标本送检人签字： 标本接受人员签字：,乙型肝炎病毒核心IgM抗体诊断试剂盒（ELISA法）操作说明原理:采用捕获法ELISA原理，用抗人 链捕获待测血清中特异性I g M，洗板侯加入抗原结合酶进行二次温育。当样品中存在核心I g M抗体时，形成”抗 链- I g M抗体-抗原结合酶“复合物。最后加底物显色。标本要求：血清或血浆，样本量足够；污染、标本量不足、严重溶血标本不宜作此项检测试剂生产厂家：北京万泰生物药业股份有限公司包装规格：48人份/盒试剂盒组成：包被反应板， 酶标试剂， 阳性对照血清， 阴性对照血清， 浓缩洗涤液，显色剂A液，显色剂B液，终止液，封口膜，密封袋。试剂储存条件及有效期：2 - 8C 保存,操作步骤,1、 平衡： 将试剂盒取出， 平衡至室温30min，微孔板开封后， 余者及时以自封袋封存。标本也需室温平衡30min 。 2、 配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（ 如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1： 1 9 稀释后使用。3、 编号： 将微孔条固定于支架， 按序编号，设阴阳性对照各2孔和空白对照1孔（双波长可不设空白孔）。4、 稀释：将待测标本用生理盐水做1：1000稀释（质控品及阴阳性对照不稀释）5、 加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴阳性对照100ul，6、 温育：封板、37温育30分钟。7、 洗涤：5遍，最后1次尽量扣干8、 加酶：每孔加酶标试剂100ul，空白孔除外9、 温育：同步骤610、洗涤：同步骤711、显色：每孔加入显色剂A、B液各50ul，混匀， 37避光显色15min12、测定：每孔加入终止液50ul，混匀，10min内测定结果。设酶标仪波长450nm（建议用双波长450/600-650nm检测），用空白孔调零后测定各孔A值。,参考范围,阴性对照的正常范围：正常情况下，阴性对照孔A值0.1（若有1孔阴性对照孔A值大于0.1应舍弃该空，弱两孔或以上阴性对照孔A值都大于0.1，应重复实验。阳性对照的正常范围：正常情况下，阳性对照孔A值0.8,结果判定,临界值（CUTOFF)计算：临界值=阴性对照孔A均值2.1阳性判定：样品A值临界值（CUTOFF)判为阳性阴性判定：样品A值临界值（CUTOFF)判为阴性,注意事项,待测样品要求冷冻样品实验前需溶解并混匀，使用前请将样品室温平衡30分钟以上。如样品有杂质、浑浊现象，检测前应3500转/分离心5分钟，取上清液检测,续,待测样品1：1000稀释方法-非常关键稀释液为0.9%生理盐水。稀释方法:尽可能连续倍比稀释（1：10，连续3次）不建议直接在1ml生理盐水中加入1l血清,此种操作容易出现误差。,续,实验操作严格按照标准操作步骤进行。每次均需设阴性和阳性对照原始记录：完整的实验原始记录，如试剂批号，结果原始OD值，并保存好原始记录。每次实验结束后，将结果及时填写在抗-HBc IgM 1:1000标本检测登记表.doc，注意表中请增加两点，试剂批号和结果原始S/CO值:s为标本OD值，CO为该批标本检测判定的临界值，二者的比值。,抗-HBc IgM 1:1000标本检测登记表 （乙肝监测项目用）. 省（直辖市） 市 县（市、区）试剂生产厂家： 试剂批号：,注：1.“报告卡编号”为NNDRS中自动生成的病例编号（18位）；2.“检测结果”在相应位置填写：1=阳性；2=阴性；3=未检测。检测单位： 检测人员：,续,试剂使用试剂在使用之前室温平衡30分钟。国产试剂为定性试剂，不能作为定量试剂使用。不同批次试剂最好不要混用。一次检测未使用完的剩余试剂注意密封，保持干燥和洁净。,避免在有挥发性物质及次氯酸类消毒剂（如84消毒液）的环境下操作。加液时须用加样器，并经常校对加样器的准确性。加入不同样品或不同试剂组分时，应更换加样器吸头和加样槽。封板膜不能重复使用，以防出现交叉污染。所用样品，废液和废弃物都应按传染物处理，终止液为硫酸，使用时注意安全。,其它注意事项,样本上送,县级送检到省级：每月20日前，冷藏运送至省疾控中心病毒性肝炎实验室标本：未明确诊断慢性乙肝病例全部剩余血标本（县级需检测）必须用2ml螺旋口血清保存管，按顺序放置于血清保存盒标本标记：用记号笔标记样本编号，最好再标记上姓名标本送检表：抗-HBc IgM 1:1000标本检测登记表（含试剂批号和标本S/CO原始值），填写完整。明确诊断为慢性乙肝者血标本（县级不必检测）必须用2ml螺旋口血清保存管，按顺序放置于血清保存盒标本标记：用记号笔标记样本