荧光原位杂交技术及其应用

荧光原位杂交技术及其应用荧光原位杂交技术及其应用 摘要 摘要 荧光原位杂交技术是一种非常有用的分子细胞遗传学工具 特别是对一些染色体数 目异常和复杂染色体异常的诊断 架起了染色体显带技术和分子遗传学之间的桥梁 本文 主要就荧光原位杂交技术的发展历程 探针制备和临床应用做一简单的综述 关键词 关键词 FISH 荧光原位杂交 临床应用 产前诊断 肿瘤 Fluorescence in situ hybridization and applications SUN Jingjing YAN Shouqing College of Animal Science and Veterinary Medicine Jilin University Changchun 130062 China Abstract FISH is a powerful molecular cytogenetic technique which allows rapid detection of numerical and complex chromosome aberrations on interphase cells and metaphase spreads bridging the gap between conventional chromosome banding analysis and molecular genetic DNA studies This review gives a brief overview of the historical developments of FISH techniques and applications in clinic genetic diagnostics Key words FISH Fluorescence in situ hybridization Clinical applications Prenatal diagnosis Tumor DNA荧光原位杂交 fluorescence in situ hybridization FISH 技术是一种应用非放射性荧 光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法 1 该技术具有 快速 安全 灵敏度高以及探针可长期保存等特点 目前已广泛应用于细胞遗传学 肿瘤 生物学 基因定位 基因作图 基因扩增 产前诊断及哺乳动物染色体进化研究等领域 1 FISH 技术的产生技术的产生 1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞 核内的rDNA获得成功之后 Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模板 利用体外合成的含3H 的RNA为探针成功地与中期染色体标本进行了原位杂交 从而开创了RNA DNA的同位素 原位杂交技术 2 但是没有得到广泛应用 1974年Evans第一次将染色体显带技术和原位杂 交技术结合起来 提高了基因定位的准确性 1981年 Langer等首次采用生物素标记的核 苷酸探针 bio dUTP 成功地进行了染色体原位杂交 建立了非放射性原位杂交技术 Nonisotopic in situ hybridization 至此 以荧光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂 交的技术建立起来 1985年这项技术被引进到植物 1986年 Cremer与Licher等分别证实 了荧光原位杂交技术应用于间期核检测染色体非整倍体的可行性 从而开辟了间期细胞遗 传学研究 3 2 FISH 的原理的原理 荧光原位杂交技术原理是将DNA探针用生物素和毛地黄毒苷等荧光染料标记 然后将 标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上 再用与荧光素分子偶联的单克隆抗 体与探针分子特异结合 通过荧光杂交信号来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位 定性 相对定量分析 与其他原位杂交技术相比 荧光原位杂交具有很多优点 主要体现 在 FISH不需要放射性同位素作探针标记 安全性高 FISH的实验周期短 探针稳 定性高 FISH能通过多次免疫化学反应 使其杂交信号明显增强 从而提高灵敏度 检测的灵敏度接近同位素探针杂交 FISH的分辨率高达3 20Mb FISH可以用不同修 饰核苷酸分子标记不同的DNA探针 再用不同的荧光素分子检测不同的探针分子 因此可 以在荧光显微镜下在同一张切片上同时观察几种DNA探针的定位 直接得到它们的相关位 置和顺序 从而大大加速生物基因组和功能基因定位的研究 4 3 FISH 技术的发展技术的发展 在20世纪90年代 FISH在方法上逐步形成了从单色向多色 从中期染色体FISH向粗线 期染色体FISH再向fiber FISH的发展趋势 灵敏度和分辨率也有了大幅度的提高 3 1 多色荧光原位杂交 M FISH 多色原位杂交 M FISH M 分别代表 Multicolor Multiplex 和 Multitar get 3种类型 M FISH的最大特点是 可将多次繁琐的FISH实验和多种不同基因的定位在 一次FISH实验中完成 Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰荧光素 AFA 标记探针建立了双 色FISH 技术 1990年Nederlof等提出用3种荧光素探测3种以上的靶位DNA序列 创建了多 色FISH方法 以下五种方法是在多彩色FISH基础上发展起来的新技术 染色体描绘 chromosome paint ing 比较基因组杂交 comparative genomic hybridization CGH 光谱染 色体自动核型分析 spectral karyotyping SKY 交叉核素色带分析 cross species color banding Rx FISH 多彩色原位启动标记 multicolor primed in situ labeling multicolor PRINS 5 3 2 DNA 纤维荧光原位杂交技术 DNA fiber FISH Wiegant等和Heng等首先利用化学方法染色体进行线性化 再以此线性化的染色体 DNA 作为载体进行FISH 使FISH的分辨率显著提高 就是最初的纤维 FISH Parra和 Windle 1993 Heiskanen等 1994 Florijn等 1995 进一步改进了伸展DNA纤维的方法 使DNA纤维的伸展程度从最初的80kb m达到了现在的2 5 3 5kb m 这一数值与Watson Crick建立的DNA双螺旋模型中B DNA分子的理论值2 97kb m十分接近 因此可以说现在 得到的DNA纤维基本上是裸露的双螺旋DNA分子 纤维 FISH的关键就在于何制备高质量 的线性DNA纤维纤维 FISH具有高分辨率 能进行定量分析 模板要不高 只需分析少量的 DNA分子 10个 灵敏度高等优点由于纤维 FISH的这些优点使得它在染色体图谱绘制 基因重组研究以及临床染色体基因序列检测工作中起着十分重要的作用 1 3 3 组织微阵排列技术 tissue microarray Microarray可以在1次实验中检测出数百个基因在1个细胞中的表达情况 包括降低和增 高 Tissue array则在1次实验中能检测出1个基因在数百个细胞中的表达情况 Tissue microarray是由Tissue microarray区域中500 1000单个肿瘤组织联合筒状活检构成的 将活检 组织切成200多片用于DNA RNA探针 单个杂交提供单个载玻片上所有样本的信号 以 后的切片可以用其他探针或抗体分析 同一个组织样本切片的多重叠区域可以形成数千张 切片 6 组织和cDNA微阵排列技术相结合提供一种有力的体内鉴定基因的方法 可以对癌 或其他疾病的分子改变做出重要评估 3 4 荧光免疫核型分析和间期细胞遗传学 fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics FICTION FICTION是1种将免疫核型分析和原位杂交相结合的方法 这种方法可以同时显示异种 细胞群中单个肿瘤细胞的免疫表型和一定的基因改变 FICTION形态学有关 可以对档藏 材料作回顾性研究 7 FICTION诊断快速 可以再现 适合FISH分析前或后没有所需以前 细胞标本的细胞学样本 8 FICTION可用于分析血液肿瘤的系谱以获得对肿瘤病理组织更 好的了解 4 FISH技术的应用技术的应用 FISH技术已经在细胞遗传学 肿瘤生物学 基因定位 基因作图 基因扩增 产前诊 断及哺乳动物染色体进化研究等领域得到了广泛应用 4 1 染色体结构变异与非整倍体的检测 荧光原位杂交简化了染色体结构变异的检测 如植物染色体的非整倍体是由于染色体 行为异常 即可能是双亲配子染色体数目和结构差异引起或染色体亲缘关系较远等因素导 致 利用原位杂交可比较容易地检测出缺失 附加或替换的染色体 9 4 2 基因扩增和缺失的检测 FISH空间分辨率和敏感性使得亲本和扩增基因在抗病虫害细胞中定位成为可能 10 被 扩增基因主要在同一染色体臂上 但离初始亲本基因有一定距离 且经常独立地位于染色 体端粒部位 FISH分析表明细胞断裂可能是由于染色体含有扩增区域的结构重排 同时用 FISH 可定位转基因植物中外源基因位置和拷贝数 此法在番茄 烟草 大麦 小麦 黑 麦等作物中已获成功 利用FISH技术也可检测一些与遗传性疾病相关的基因缺失 如成功 检测了aniridia疾病 一种虹膜缺失的罕见遗传异常疾病 患者的缺失基因 4 3 基因定位 荧光原位杂交的基因定位技术有着广泛的应用 PP2Ac突变型肺癌相关基因在染色体 区域的定位 荧光显微镜下观察记录和分析杂交信号的特征 结果在正常人淋巴细胞的染 色体5q23 31可见明显杂交信号 在GLC 82细胞的5号和7号染色体上出现较强信号 说明 点突变引起PP2Ac活性改变 从而基因易位 导致肺肿瘤的产生 11 FISH技术与生化 计 算机和重组DNA技术结合检测Alu位点 表明DNA序列与带型有关 用FISH技术对人类基 因组中编码基因分布的研究揭示 基因主要集中在染色体上G C 占全基因组35 最丰富 的DNA区段 FISH技术为着丝粒结构研究提供了重要手段 应用FISH技术可直接观察染色 体端粒 这简化了染色体在核内的结构和功能研究 4 4 基因作图 用FISH技术可直接检测DNA在染色体上的位置 所确定位置是基因在染色体上实际的 物理位置 由于原位杂交不受位点内变异和位点间拷贝数的影响 FISH技术已成为重复序 列和多基因家族作图的重要手段 如M C lark等用荧光原位杂交方法在大麦第5号染色体制 作出B 醇溶蛋白位点的物理图谱 多色探针标记为探针定位提供了一种更简便的方法 如 检测时2个探针用红色 第3探针用绿色 则绿色位点的位置要么在2红色位点之外 要么在 它们之间 于是可确定探针顺序 因此 探针被至少20kbp的序列隔开就可以用FISH技术 将之定位 3 4 5 产前诊断 FISH技术最先在美国用于产前诊断 早在1993年FISH技术就被美国遗传学会 ACMG 允许用于产前辅助诊断 最终的确诊还需要依赖核型分析 而到2000年鉴于 FISH技术具有高度的敏感性和特异性 ACMG宣布FISH技术可以用于常见染色体数目异常 的确诊 而不再仅仅作为辅助性产前诊断手段 在2001年 Tepperberg等 12 对FISH技术进 行快速产前诊断的结果与核型分析结果进行了大样本比较 共47312份有效标本中 FISH 法仅有9例出现了假阳性结果 假阳性率为0 019 有32例出现了假阴性结果 假阴性率 为0 049 FISH进行快速产前诊断具有非常高的灵敏度和特异度 可以用于常见的染色体 数目异常的诊断 此后 FISH技术在一些发达国家被广泛用于快速产前诊断 FISH适用于多种标本 如羊水细胞 绒毛细胞 胎儿有核红细胞及着床前胚胎卵裂细 胞等 13 且不仅适用于中期染色体 也适用于间期核及细胞周期的所有阶段 FISH的突出 优点是可快速得出结果 与历时7 12 d的细胞培养进行传统染色体显带分析相比 FISH可 在24 48 h内完成 减少染色体病筛查试验阳性患者在焦虑中的等待时间 让临床医生尽 早做出诊断 制定进一步诊疗方案 与放射性原位杂交相比较 FISH技术无放射性同位素 污染 不需要特殊的安全防护 且敏感性与同位素检测相当 完全可以取代放射性原位杂 交而成为一种新的检查方法 14 4 6 染色体RNA和基因组进化研究 染色体的主要成分包括DNA和组蛋白 除此之外 还有非组蛋白和RNA 对这些物质 在染色体中分布进行精确定位是研究染色体高级结构和构建染色体模型的关键所在 人们 对染色体中DNA和蛋白质研究已比较深入 但对染色体中RNA的性质 种类 来源 分布 特点及生物学功能缺乏深入研究 宋林生等 15 用生物素标记的玉米18s rRNA小麦5s rRNA 及tRNA的cDNA作为探针 利用玉米根尖超薄切片进行原位杂交 证实玉米染色体中既有 来自核仁的rRNA或其前体 又含有来自核基质的rRNA 5s rRNA或hnRNA 核内不均一 RNA 揭示了染色体中RNA的种类和来源 4 7 血液肿瘤检测 血液肿瘤是我国十大高发肿瘤之一 随着对疾病发病机制的深入研究 发现细胞遗传 学对肿瘤分型 诊断 治疗和预测预后都具有重要的意义 在临床上对血液肿瘤的FISH检 测主要集中在以下几个方面 染色体异位形成的融合基因检测 基因缺失的检测 一 些关键基因的缺失有助于我们对肿瘤进行诊断以及预后判断 微小残留病灶的检测 对异性间造血干细胞移植的植入状态监测 4 8 在实体瘤中的应用 FISH几乎可以快速检测任何类型组织细胞的染色体异常 不管组织是新鲜的或是一些 甲醛溶液 福尔马林 固定的陈旧组织标本 因此 FISH被广泛接受用于乳腺癌 膀胱癌 宫颈癌 肺癌 淋巴瘤等实体瘤的辅助诊断 其目的主要集中在对肿瘤的早期诊断 疗效 检测 个体化治疗和预后判断等几个方面 16 总之 FISH技术在临床中的应用已经得到迅速的发展 灵敏度和特异度明显改善 可 供选择的商业化探针也越来越多 但是 由于目前仪器设备和探针价格过于昂贵 以及对 于操作人员技术水平要求也较高 在一定程度上限制了FISH 技术在临床上的应用 特别 是在我国 仅有一些大医院开展了FISH项目 检测范围也仅限于血液性肿瘤 乳腺癌以及 产前诊断方面 其他检测项目开展较少 因此 在今后的一段时间 为了使FISH得到更广 泛的应用 怎样降低成本 简化操作步骤仍是科研人员面临的一个难题 参考文献参考文献 1 梁毓 王树玉 贾婵维 荧光原位杂交技术的研究进展 J 中国优生与遗传杂 2005 13 5 119 120 2 Pardue ML Gall JG Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations J Proc Natl Acad Sci USA 1969 64 2934 2938 3 陈成忠 于洪芹 荧光原位杂交技术及其应用 J 生物学教学 2007 32 1 2 4 4 卢军 李乐玉 朱利泉等 荧光原位杂交技术的研究进展及其在染色体识别应用中的展望 安 徽农业科学 2008 36 3 911 913 5 Carter NP Cytogeneic analysis by chromosome painting J Cytometry 1994 18 1 2 10 6 Khan J Saal LH Bittner M L et al Exprission profiling in cancerusing cDNA microarrays J Electrophoresis 1999 20 2 223 7 Gremer T Lundegen J et al Detection of chromosom eaberration in the human in terfuse nucleus by visualizat ion of special target DNAs with radioactive and nonradioactive in situ hybridizationt echniques diagnosis of trisomy 18 with probe L184 J Hum Genet 1986 74 346 352 8 Cai LS Lim AS Tan A Rapidone day fluorescence in situ hybridization in prenatal diagnosis using uncultured ammiocytes and chorionic villi J Ann Acad Med Sing