实验三血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳ppt课件.ppt

实验三血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳 1 注意 自己带铅笔 尺子 实验时间 第11周 星期一 2 一 实验目的 1 了解电泳的基本原理 2 掌握电泳分离蛋白质的原理 3 掌握醋酸纤维素薄膜电泳的方法 3 二 实验原理 1 电泳的基本原理电泳 是带电质点在电场力作用下发生定向移动的现象 电泳技术 是利用电泳现象进行物质分离 纯化及鉴定的技术 4 电泳速度的方向 电泳速度的大小 当F F 时 粒子在电场中匀速运动 运动速度 5 E 电场强度 Q 粒子所带的净电荷 r 粒子半径 溶液的粘度 在同一电场环境中 带电粒子的迁移速率只与本身所带电荷 粒子半径有关 6 i 粒子所带电荷越多 半径越小 泳动速度就越快 ii 所带电荷越少 半径越大 泳动速度就越慢 7 2 电泳分离蛋白质的原理 当pH PI时 所带电荷为0 粒子是静止的 当pH PI时 酸性电离 释放氢离子 带负电 运动方向是从负极向正极移动 当pH PI时 碱性电离 结合氢离子 带正电 运动方向是从正极向负极移动 当pH距离PI越远时 所带电量越多 8 血清蛋白质的等电点为4 8 7 5 均低于8 6 因此电泳时常采用pH8 6的缓冲液 此时 蛋白质解离带负电荷 在电场中向正极移动 由于各种血清蛋白的等电点不同 在同一pH下带的电荷数也不同 加上各蛋白质的分子大小也有差别 因此在电场中的移动速度不同 带电荷多 相对分子量小的蛋白质泳动较快 带电荷少 相对分子量大的泳动较慢 这样各种血清蛋白质在同一时间内泳动的距离就不同 从而可将血清蛋白分离成数条区带 2 电泳分离血清蛋白质的原理 9 4 醋纤膜分离血清蛋白质的原理 醋酸纤维素薄膜电泳是采用醋酸纤维素薄膜作支持物的一种电泳技术 醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯 具有均一的泡沫状结构 渗透性强 对分子移动阻力小 用它做区带电泳的支持物 用样量少 分离清晰 对染料无吸附作用 应用范围广 快速简便 且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明 透明后的薄膜便于保存和定量分析 因此 目前被广泛用于血清蛋白 脂蛋白 血红蛋白 糖蛋白 酶的分离和免疫电泳等方面 10 醋纤膜分离血清蛋白质的方法 以醋酸纤维素薄膜作为支持介质 于薄膜一端加微量血清 膜两端连接于缓冲液 电泳分离后再经染色处理 可将血清蛋白质分成五条主要的区带 从正极依次为清蛋白 1 球蛋白 2 球蛋白 球蛋白 球蛋白 11 三 主要试剂与器材 试剂 血清巴比妥缓冲液染色液 漂洗液器材 电泳仪 电泳槽醋酸纤维素薄膜 2 8cm 血清加样器 12 四 操作步骤 1 浸膜 将裁好的醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中 充分浸透后用镊子取出用两片滤纸吸干 约20min 直到膜上没有斑点 中间没有气泡为止 2 点样 毛面向上 用点样器 在距膜一端约2cm处 与边缘平行直线状点加3 5 L待分离血清 注意取样适量 均匀 血清线位置适当 粗细均匀 不能有明显扩散现象 13 不同的点样方式 正确点样 直 细 2cm 14 错误的点样方式 量多 条带粗 结果 15 错误的点样方式 量少 条带不清晰 结果 16 如何正确点样 1 3mm宽的细长 均匀 连续条带 1 移液器的尖嘴 旁边不沾液滴 2 移液器的尖嘴蘸点血清后 较快划一次 血清的高度 决定尖嘴液面的高度 决定血清线漫开的宽度 17 3 搭桥 首先将双层滤纸铺好 分别放置于电泳槽两端 其下端要浸入缓冲液中 注意 无光泽面朝下 血清线不碰到盐桥上的滤纸 膜的 与电泳槽的 极 极方向一致 醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图 18 水平电泳槽 19 4 电泳 红正黑负 电压 100V 电泳时间约60min 每人只能放一张膜 最后有空位才可放第二张膜 20 5 染色 氨基黑10B 染色3 5min 镊子夹膜的两边 不夹中间 浸泡时 一条一条地浸 确保每条膜都被染色液完全包裹 21 6 漂洗 在装有漂洗液的2个漂洗缸中 依次漂去多余染料 直到背景漂白为止 尽量滴干染色液 一条一条地移 漂洗液的作用 洗去未结合蛋白质的游离染料 染色皿 漂洗皿 22 五 结果与分析 1 定性观察 指出薄膜上可显现清楚的五条区带分别是什么 23 吸水纸上 逐一摆开 找到自己的那条 24 六 注意事项 1 点样时 毛面向上 要求样线粗细均匀 无明显扩散现象 2 搭桥时 光面向