弯曲菌与螺杆菌

第十二章 弯曲菌与螺杆菌李向阳,弯曲菌属与螺杆菌属,弯曲菌属与螺杆菌属是分类学上两个独立的菌属大小及形态相似，显微镜下为革兰染色阴性菌，呈弧形或螺旋形菌，较难区别为了便于鉴别诊断，将这两类细菌放在同一章介绍,第一节 弯曲菌属,弯曲菌属（Campylobacter）是一类呈逗点状或S形的革兰阴性菌，广泛分布于动物界其中有些可引起动物与人类的腹泻、胃肠炎和肠道外感染等疾病对人致病有空肠弯曲菌、大肠弯曲菌、胎儿弯曲菌等，其中空肠弯曲菌是腹泻的常见病原菌,一、分类,弯曲菌原归属于弧菌属，1973年正式命名为弯曲菌属Campylobacter源自希腊语意为弯曲的杆状1984年在伯杰手册中将其分为5个种(亚种)。近年来发现了弯曲菌的许多新种和亚种。,二、临床意义,空肠/大肠弯曲菌广泛分布于温血动物。未经处理的水以及生牛乳是人类感染的主要来源。弯曲菌的传播途径主要以食物和水的传播为多见，经口摄入是本菌最主要的传播方式腹泻是空肠弯曲菌感染最常见的临床表现感染后可引发吉兰-巴雷综合症和反应性关节炎胎儿弯曲菌主要引起肠外感染其中胎儿亚种为主要的人类致病菌可致人类菌血症、心内膜炎、血栓性静脉炎、活动性关节炎、脑膜炎、肺部感染、胸膜炎、腹膜炎、胆囊炎等,三、生物学特性,革兰阴性，菌体弯曲呈逗点、弧形、S形、螺旋形或典型的海鸥展翅（gull wing）形。陈旧培养物可呈球形或长丝状。无芽胞。通常空肠/大肠弯曲菌的鞭毛是较细且紧密盘绕的两端单鞭毛；胎儿弯曲菌胎儿亚种的鞭毛为波浪状的一端单鞭毛。弯曲菌的运动非常活泼，呈投镖样或螺旋样前进弯曲菌的基因组为16001700kb，DNA G+C 3038mol%。,三、生物学特性,本属细菌的抗原成分有菌体(O)抗原、热不稳定抗原(HL系统)和鞭毛(H)抗原。根据O抗原不同，将空肠弯曲菌和大肠弯曲菌分为65个血清型。根据HL系统抗原，将空肠弯曲菌、大肠弯曲菌和海鸥弯曲菌至少分160个血清型,三、生物学特性,弯曲菌为微需氧菌，空肠弯曲菌和其他大多数弯曲菌生长时需氧浓度为5%10%（V/V）。最佳气体环境为含5%氧气、10%二氧化碳及85%氮气细菌抵抗力不强，室温可迅速死亡。对热敏感，标本在4冰箱可保存3周。,四、微生物检验,(一)检验程序,（二）微生物检验,标本采集 采取新鲜粪便与肛拭子、血液、脑脊液等立即送检。如不能及时送检应种入Cary-Blair运送培养基，放4冰箱保存。血液、脑脊液标本应先进行增菌。,（三）标本直接检查,直接显微镜检查粪便与肛拭子可直接镜检，查找革兰阴性呈弧形、S形、“海鸥形”或螺旋形的小杆菌；或用暗视野或相差显微镜观察，查见该菌呈投镖式或螺旋式运动可初步诊断核酸检测 PCR方法直接检测粪便标本中的弯曲菌，但目前尚未被广泛采用,（四）分离培养与鉴定,1. 分离培养粪便或肛拭标本直接接种改良Campy-BAP选择平板血、脑脊液标本先接种于布氏肉汤增菌后转种分离培养基微氧环境培养空肠/大肠弯曲菌最适生长温度4243，24h可观察菌落，如于37培养则需4872h胎儿弯曲菌于25和37均可生长临床标本需分别置37和42中培养，方不致漏检。在同一培养基上出现灰白、湿润、扁平边缘不整的蔓延生长菌落及半透明、圆形、凸起、有光泽的小菌落等两种菌落,2鉴定,鉴定要点： 弯曲菌属鉴定要点：氧化酶阳性，革兰阴性，菌体弯曲 或呈S形，生长温度 (25、37、42)试验；奈啶酸、头孢噻吩敏感试验空肠弯曲菌对奈啶酸敏感、对头孢噻吩耐药；胎儿弯曲菌对奈啶酸耐药、对头孢噻吩敏感。但近年出现对奈啶酸耐药的空肠弯曲菌马尿酸盐水解试验凡马尿酸盐水解试验阳性、42生长、氧化酶阳性、与镜检形态相符者，即可报告空肠弯曲菌空肠亚种 醋酸吲哚水解试验空肠弯曲菌阳性，胎儿弯曲菌阴性,（五）其他方法测定,免疫学方法用特异性抗体包被的乳胶颗粒，可用于鉴定空肠/大肠弯曲菌。也可采用酶免疫方法测定粪便中弯曲菌抗原进行诊断。血清中抗体测定用于流行病学调查DNA探针和PCR扩增 DNA-DNA杂交在弯曲菌菌种的分类研究中是一种成功的参考方法。PCR扩增技术也正在发展中,第二节 螺杆菌属,螺杆菌属（Helicobacter）：细菌有20余种， 有9个种可从人体分离到能引起人类疾病菌种幽门螺杆菌(H. pylori)、 H. fennelliae和H. cinaedi。幽门螺杆菌与萎缩性胃炎，胃、十二指肠溃疡和胃癌等疾病相关其他螺杆菌也可感染胃粘膜，但少见。本章主要叙述幽门螺杆菌。,诺贝尔生理学和医学奖,1983年Marshall和Warren首先用微需氧技术从慢性胃炎、消化性溃疡患者的胃粘膜分离出弯曲状的细菌，并证明该细菌感染胃部会导致胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡，由此获得了2005年诺贝尔生理学和医学奖,一、分类,最初因形态、分离培养方法与弯曲菌属细菌相似，又仅从胃标本中分离到，被称作胃弯曲菌样细菌由于此菌在胃窦部多见，且形态、培养及某些生化特性与弯曲菌属相似，DNA G+Gmol%也在弯曲菌属范围内，故命名为幽门弯曲菌(campylobacter pylori)1989年Goodwin等根据该菌的超微结构、形态、菌体脂肪酸组成、生长特征和酶的活力、16S rRNA 序列等，提出该菌不应归于弯曲菌属，后称为幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, HP),二、临床意义,HP感染非常普遍。该菌为一种高度适应或只能生活于胃粘膜的细菌，菌体周围微环境的pH值为7.0。胃窦为其定植的最佳部位HP感染与慢性浅表性胃炎或萎缩性胃炎之间的病因关系已充分确立。流行病学资料表明胃癌发病率在一些HP感染率高的人群中较高,HP致病机理,尚不清楚，可能与下列因素有关：特殊的螺旋状和端鞭毛有助于HP穿过胃粘膜表面粘液层与胃粘膜上皮细胞接触；具有高活性胞外脲酶分解尿素，产生氨中和菌体周围胃酸，有助于细菌定植；细胞毒素相关蛋白（CagA）和空胞毒素（VacA）VacA在体外能诱导多种哺乳动物细胞胞发生空胞变性，体内导致小鼠胃粘膜上皮细胞损伤和溃疡形成。CagA与致病岛的picB紧密相连，协同诱导胃粘膜上皮细胞产生多种细胞因子，吸引炎症细胞释放多种酶类致胃组织损伤。cag A基因与胃癌发生密切相关。,三、生物学特性,菌体细长弯曲呈螺形、S形或海鸥形。菌体一端或两端可有多根带鞘鞭毛，运动活泼。菌体长2.54.0m，宽0.51.0m。革兰染色阴性，有动力。在胃粘膜上皮细胞表面常 呈典型的螺旋状或弧形。固体培养基上生长时，除典型形态外，有时可出现 杆状或圆球状。电镜下菌体的一端可伸出26条带鞘鞭毛。鞭毛长为菌体11.5倍，粗约30nm。鞭毛在运动中起 推进器作用，在定居过程中起锚住作用。,三、生物学特性,HP基因组约1.67106bp，DNA G+C百分含量为37mol%，其全部序列已有报道研究较多和较重要的基因有脲酶基因ure A、ure B、ure C，细胞毒素相关基因cag A，空泡毒素基因vac AHP菌株间具有共同抗原,三、生物学特性,为微需氧菌，在5%O2、10%CO2、85%N2的环境中生长良好。最适生长温度为37。相对湿度在98%以上为宜营养要求较高，一般需含血液或血清才能生长，常用的培养基有哥伦比亚血琼脂、心脑浸液血琼脂、布氏菌血培养基等,三、生物学特性,HP生长缓慢，需经4872h才长出菌落圆形孤立的小菌落，无色半透明呈露滴状，直径约0.51mm，血平板上有轻度溶血。沿接种线扩散生长，融合成片，扁平，无色半透明HP生化反应不活跃，不能利用糖类；具有大量高活力的胞外脲酶，产生的脲酶相当于普通变形杆菌的2070倍。此外还产生氧化酶、触酶、碱性磷酸酶、-谷氨酰转肽酶和DNA酶等pH降至3.5以下时活力明显减弱生理浓度的胆盐可抑制HP生长,四、微生物检验,（一）检验程序,（二）微生物检验,标本采集经胃镜用活检钳于近幽门部、胃窦部或病变邻近处取材，最好采取多位点样品应立即行床边接种或放入20%葡萄糖运送液0.5ml内，4中保存不超过5h受检者术前应停服铋剂或抗菌药物一周,（三）标本直接检查,1. 直接显微镜检查 涂片或悬滴观察将活检组织研碎，涂片或悬滴，置相差或暗视野显微镜下可见HP形态典型、运动活泼直接涂片染色镜检将活检粘膜组织在玻片上涂抹后，经革兰染色或单染色后镜检，如发现典型形态的HP即可诊断组织切片染色镜检组织块经福马林固定、切片经W-S银染色、姬姆萨染色、HE染色和荧光染色等染色后镜检HP，以W-S银染效果最好免疫组化用免疫组化法可检出胃粘膜组织切片中的完整HP及破碎的菌体或抗原成分间接免疫荧光法（IIF）,2快速脲酶试验,Christensen尿素培养基将小块的活检组织块放入装有培养基的瓶内，如培养基由黄变为红色为阳性。提示由该菌产生的高活性的脲酶已将尿素分解，结果常在几分钟至24小时内得到,3核酸检测,现有的方法是从克隆的HP染色体DNA的特异性片段中构建引物从HP脲酶A基因序列中构建引物用PCR扩增结合限制性内切酶多态性分析技术鉴别HP可检测出不能分离培养的HP,4粪便标本抗原检测,可采用ELISA方法直接测定粪便标本中的抗原。适用于不能进行13C或14C标记尿素呼吸试验或胃镜检查的患者,（四）分离培养与鉴定,分离培养宜用新鲜配制的选择培养基。将标本的粘膜面在平板上反复涂擦，或将标本研碎后用研磨棒蘸取适量匀浆接种将接种后的平板放入微需氧和98%以上湿度的环境培养鉴定主要根据菌落特征、形态和染色性；37生长；氧化酶和触酶均阳性、脲酶强阳性；对萘啶酸耐药、头孢噻吩敏感；在1%甘油和1%胆盐中均不生长。HP的主要培养和生化特性见表12-3,（五）抗体检测,用血清学方法检测患者体内的抗HP抗体（IgG、IgM和IgA）系最常用的无创伤性诊断HP感染的方法目前已有补体结合试验、胶乳凝集试验及ELISA等，而以ELISA应用最为广泛，现有商品化的ELISA、胶乳凝集试验试剂盒用于检测患者血清中HP的菌体抗体或脲酶抗体,（六）13C或14C标记尿素呼吸试验,基本方法是患者禁食一夜，进食用13C或14C标记的尿素，HP产生的脲酶分解尿素释放带有同位素的CO2，因此可测定患者呼气中释放带有同位素的CO