多糖各种提取方法

一 植物多糖的提取 1 溶剂提取法 1 1 水提法 水对植物组织的穿透力强 提取效率高 在生产上使用安全 经济 用水作溶 剂来提取多糖时 可以用热水浸煮提取 也可以用冷水浸提 一般植物多糖提 取采用热水浸提法 该法所得多糖提取液可直接或离心除去小溶物 或者利用 多糖不溶于高浓度乙醇的性质 沉淀提纯多糖 但由于不同性质或不同相对分 子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同 它也可以用于样品中不同多糖组分的分 级分离 还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的 多糖进行分离 其中 以乙醇沉淀最为普遍 但以根茎为主的植物体 细胞壁多 糖含量高 热水直接提取率不高 此时为破坏细胞壁 增加多糖的溶出 有两种处 理方法 一为酶解 二为弱碱溶解 1 2 酸碱提法 有些多糖适合用稀酸提取 并且能得到更高的提取率 但酸提法只在一些特定 的植物多糖提取中占有优势 目前报道的并不多 而且即使有优势 在操作上 还应严格控制酸度 因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂 有些多糖在碱液中有更高的提取率 尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖 采用的稀碱多位为 0 1mol L 氢氧化钠 氢氧化钾 为防止多糖降解 常通 以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾 同样 碱提优势也是因多糖类的不同而异 与酸提类似 碱提中碱的浓度也应得到有效控制 因为有些多糖在碱性较强时 会水解 另外 稀酸 稀碱提取液应迅速中和或迅速透析 浓缩与醇析而获得 多糖沉淀 1 4 生物酶提取法 酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术 在多糖的提取过 程中 使用酶可降低提取条件 在比较温和的条件中分解植物组织 加速多糖 的释放或提取 此外 使用酶还可分解提取液中淀粉 果胶 蛋白质等的产物 常用的酶有蛋白酶 纤维素酶 果胶酶等 1 5 超声提取法 超声波是一种高频率的机械波 其主要原理是利用超声波产生的 空化作用 对 细胞膜的破坏 有利用植物有效成分的释放 而且超声波能形成强大的冲击波 或高速射流 有效地减小 消除与水相之间的阻滞层 加大了传质效率 有助 于溶质的扩散 另外 超声波的热效应使水温基本在 57 对原料有水浴作用 超声波提取与传统的提取方法相比 有提取效率高 时间短 耗能低等优点 超声提取的影响因素有 超声时间 超声频率 一般低频中提取效率高 但也 有例外 料液比和温度等 1 6 微波提取 微波是频率介于 300MHz 和 300GHz 之间的非电离电磁波 微波提取的原理是 微射线辐射于溶剂并透过细胞壁到达细胞内部 由于溶剂及细胞液吸收微波能 细胞内部温度升高 压力增大 当压力超过细胞壁的承受能力时 细胞壁破裂 位于细胞内部的有效成份从细胞中释放出来 传递转移到溶剂周围被溶剂溶解 微波技术应用于植物细胞破壁 有效地提高了收率 具有穿透力强 选择性高 加热效率高等特点 影响微波浸提的主要因素为浸提时间 样品和提取溶剂的 含水量 溶剂的介电常数和电导率 介电常数和电导率的溶剂对微波的吸收较 好 微波功率等 但是由于微波泄漏对操作者影响很大 因而对设备的要求 较高 这对微波的研究及应用带来了一定的困难 二 植物多糖的分离纯化 在多糖提取物中 常会有无机盐 蛋白质 色素及小分子物质等杂质 必须分 别除去 一般是先脱除非多糖组分 再对多糖组分进行分级 2 1 除蛋白 除蛋白质时一般选择能使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的试剂来处理 如酚 三 氯乙酸 鞣酸等 但必须处理时间短 温度低 避免多糖降解 Sevage 法 氯仿 戊醇 丁醇 4 1 和三氟三氯乙烷法在避免降解上有较好效果但要达 到除尽游离蛋白质的目的仍需反复处理 如能加入蛋白质水解酶 使蛋白质大 分子进行一定程度的降解 再用 Sevage 法处理 一般效果更好 为了避免使用有机溶剂也可采用反复冻融的方法除蛋白 将多糖液浓缩后 一 20 室温反复冻融 7 8 次 离心除去蛋白质 另外 蛋白质在等电点时溶解 度最小 用氢氧化钙饱和液调 pH10 pH11 可除去偏碱性的蛋白质 然后再用 硫酸调 pH5 pH6 可除去偏酸性的蛋白质 冻融和等电点沉淀除蛋白质操作 简单 但多糖液里往往有低浓度的蛋白质残留 应与其它方法结合使用 2 2 脱色 植物多糖提取物中含有酚类化合物而使其颜色较深 可用吸附剂 纤维素 硅藻 土 活性炭等 离子交换柱 DEAE 一纤维素 氧化剂 H2O2 等脱除 活性炭 比表面积大 吸附能力强 在进行当归多糖的提取时只向多糖液中加入了 0 1 左右的活性炭 煮沸后滤过即完成了脱色操作 此法成本低廉 适合工 业化生产 2 3 除小分子杂质 小分子杂质如低聚寡糖的残留往往影响多糖的生物活性 需要进一步脱除 提 高纯度 传统的方法是透析法 该法操作简单 技术成熟 但周期长 往往需 要 2 一 3 天 常温下操作有可能造成多糖的霉变 必要时需加入少量防腐剂或 需在低温条件下进行 随着膜分离技术的发展 纤维滤器透析法已经发展起来 了 它利用不同孔径的膜使大小不同的分子分级 这种方式可缩短生产周期 而且条件温和 无疑是多糖脱除杂质的一条新途径 2 4 多糖的分级纯化 采用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物 分级的方法可达到纯化的目 的 可按溶解性不同进行分级 按分子大小和形状分级 如分级沉淀 超滤 分 子筛 层析等 也可按分子所带基团的性质分级 2 4 1 按溶解性不同分离 2 4 1 1 分步沉淀法 分步沉淀法是根据不同多糖在不同浓度低级醇 酮中具有不同溶解度的性质 从小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮进行分步沉淀 2 4 1 2 盐析法 盐析法是根据不同多糖在不同盐浓度中溶解度不同而将其分离的一种方法 常 用的盐析剂有氯化钠 氯化钾 硫酸铵等 其中以硫酸铵最佳 2 4 2 按电离性质不同分离 2 4 2 1 季胺盐沉淀法 季胺氢氧化物是一类乳化剂 能与酸性多糖形成不溶性化合物季铵络合物 此 络合物在低离子强度的水溶液中不溶解而产生沉淀 若提高多糖液 pH 值或加 入硼砂缓冲液 也可使中性多糖沉淀分离 常用季铵盐有十六烷基三甲基季铵 盐的溴化物及其氢氧化物和十六烷基吡啶 2 4 3 柱层析法 2 4 3 1 凝胶柱层析法 凝胶柱层析法常用的凝胶有葡聚糖凝胶 Sephadex 和琼脂糖凝胶 Sepharose 以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂 从而使不同大小的多糖分子得到 分离纯化 但不适宜粘多糖的分离 2 4 3 2 纤维素阴离子交换剂柱层析法 纤维素阴离子交换剂柱层析法常用的交换剂为 DEAE 一纤维素和 ECTEOLA 一 纤维素 分类硼砂型和碱型两种 洗脱剂可用不同浓度碱溶液 硼砂溶液 盐 溶液 其优点可吸附杂质 纯化多糖 并适用于分离各种酸性 中性多糖和粘 多糖 如百合多糖 北沙参多糖 太子参多糖等 2 4 3 3 活性炭柱层析法 活性炭吸附量大 效率高 是分离水溶性物质的常用吸附剂 柱层析时活性炭 中常拌入等量的硅藻土作稀释剂 以增加溶液的流速 糖溶液上柱后先用水洗 脱无机盐 单糖等再依次增加乙醇浓度进行洗脱 2 4 3 4 离子交换柱层析和普通凝胶柱层析联用法 有些植物的多糖成分复杂 除中性多糖外 还含有糖醛酸等 因此往往两种不 同性质的色谱柱联用才能得到单一多糖组分 2 4 3 5 三种层析柱联用 采用离子交换葡聚糖凝胶柱 丙烯葡聚糖凝胶柱和葡聚糖凝胶柱三者联用 即 先进行 DEAE SephadexA 柱层析 用蒸馏水洗脱 水洗组分进一步用 SephacrylS 柱层析 得到主要组分再用 SephadexG 一 100 柱层析 有时会有 较高的得率 三 多糖的纯度鉴定 经过分级纯化的多糖在测定结构前须进行纯度鉴定 而且多糖的纯度不能用通 常化合物的纯度标准来衡量 因为即便是多糖纯品 其微观也并不均一 仅代 表相似链长的多糖分子的平均分布 通常所谓的多糖纯品也只是一定相对分子 质量范围的多糖的均一组分 目前常用于多糖纯度的鉴定方法有 高效液相 凝胶层析法 电泳法 色谱法 旋光度法等 四 常见问题 多糖制备过程中蛋白质的脱除是目前分离纯化多糖的难点 Sevag 法需要消耗 大