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1 第九章 发酵过程控制 2 本章内容 一 概述二 代谢调控在发酵过程控制中的应用三 温度对发酵的影响及其控制四 pH对发酵的影响及其控制五 溶解氧对发酵的影响及其控制六 CO2和呼吸熵对发酵的影响及其控制七 基质浓度对发酵的影响及补料控制八 高密度发酵及过程控制九 泡沫对发酵的影响及其控制十 自动控制技术在发酵过程控制中的应用 3 一 概述1 过程控制的重要性 菌株特性 营养要求 生长速率 呼吸强度 产物合成速率 传递性能物理 n T Ws化学 pH DO 浓度过程控制的意义 最佳工艺条件的优选 即最佳工艺参数的确定 以及在发酵过程中通过过程调节达到最适水平的控制 决定发酵单位 水平 的因素 外部环境因素 工艺条件 生物因素 设备性能 4 2 发酵过程控制的一般步骤 确定能反映过程变化的各种理化参数及其检测方法研究这些参数的变化对发酵生产水平的影响及其机制 获取最适水平或最佳范围建立数学模型定量描述各参数之间随时间变化的关系通过计算机实施在线自动检测和控制 验证各种控制模型的可行性及其适用范围 实现发酵过程最优控制 5 3 参数检测 代谢参数按性质可分为三类 物理参数 温度 搅拌转速 罐压 空气流量 溶解氧 表观粘度 排气氧 二氧化碳 浓度等化学参数 基质浓度 包括糖 氮 磷 pH 产物浓度 核酸量等生物参数 菌丝形态 菌体浓度 菌体比生长速率 呼吸强度 摄氧率 关键酶活力等 6 3 参数检测 参数按获取方式可分为两类 如T pH 罐压 空气流量 搅拌转速 溶氧浓度等如摄氧率 呼吸强度 QO2 比生长速率 体积溶氧系数 KLa 呼吸熵 RQ 等 直接参数 间接参数 将直接参数通过公式计算获得的 参数 7 3 参数检测 参数的测量形式离线测量 基质 糖 脂类 无机盐等 前体和代谢产物 抗生素 酶 有机酸 氨基酸等 在线测量 如T pH DO 溶解CO2 尾气CO2 黏度 搅拌转速等优点 及时 省力 可从繁琐操作中解脱出来 便于计算机控制 困难 传感器要求较高 8 对传感器的要求能经受高压蒸汽灭菌 传感器及其二次仪表具有长期稳定性 最好能在过程中随时校正 灵敏度好 探头材料不易老化 使用寿命长 安装使用和维修方便 解决探头敏感部位被物料 反应液 粘住 堵塞问题 价格合理 便于推广 3 参数检测 9 3 参数检测 参数检测方法温度测量感温元件 热电偶 温度信号 电信号 二次仪表 将热电偶输出的电信号转换成被测介质的温度 10 参数检测方法搅拌转速和搅拌功率的测量搅拌转速 磁感应式 光感应式 测速电机 搅拌功率 功率表 测定力矩求功率法 3 参数检测 11 3 参数检测 参数检测方法空气流量测定体积流量型 会引起流体能量损失 受温度和压力变化的影响 同心孔板压差式流量计 转子流量计 质量流量型 根据流体固有性质 质量 导电性 热传导性能 设计的流量计 12 参数检测方法罐压测量压力表压力传感器 3 参数检测 13 参数检测方法发酵液粘度测定毛细管粘度计回转式粘度计涡轮旋转粘度计 3 参数检测 14 参数检测方法pH测量复合pH电极pH测量仪器 3 参数检测 15 参数检测方法溶解氧的测量化学法极谱法复膜氧电极法 3 参数检测 复膜氧电极示意图 a 极谱型 b 原电池型 16 参数检测方法溶解二氧化碳测量复膜式电极法渗透膜 碳酸氢钠法发酵尾气的在线分析CO2分析O2分析 3 参数检测 17 参数检测方法细胞浓度的测量化学法 如DNA RNA分析等物理法 如重量分析 分光光度分析 浊度分析等新技术 以电容法为测量原理的在线活细胞浓度测量传感器 3 参数检测 原位活细胞在线检测仪 18 二 代谢调控在发酵过程控制中的应用1 初级代谢物的生产调节 初级代谢物 指一类低分子量的终点产物及这些终点产物的生物合成途径中的中间体 调节方法 1 避开固有的反馈调节 2 细胞通透性的变更 19 反馈调节包括 反馈抑制 某一生物合成途径的最终代谢物抑制该途径的第一或第二个酶的活性 反馈阻遏 抑制酶的形成 是由途径终点产物或其衍生物施行的 1 避开固有的反馈调节 20 1 避开固有的反馈调节 方法限制菌在胞内积累终点产物的能力以解除负反馈调节作用从遗传上改变酶的活性和酶的形成系统 筛选有抗反馈作用的基因突变型 对反馈作用不敏感 具体应用积累中间产物的能力积累终点产物的能力耐反馈作用的突变株的筛选 抗结构类似物突变株 21 抗结构类似物突变株的筛选机制 末端产物类似物和末端产物结构类似 因而能够引起反馈作用 但是它们不能参与生物合成 在培养基中添加末端产物类似物后 未突变的细胞将由于代谢途径受阻而不能获得生物合成所需的该种末端产物 从而导致细胞死亡 那些对类似物不敏感的突变株仍能制造末端产物并长成菌落 突变株耐结构类似物的原因 酶的结构起了变化 指耐反馈抑制的突变株 酶的合成系统起了变化 指耐反馈阻遏的突变株 22 2 细胞通透性的变更 细菌细胞膜通透性的增加是谷氨酸过量生产的原因之一 能过量生产谷氨酸的细菌有两个共同特征 酮戊二酸脱氢酶缺失 表明这类细菌的TCA上的酶受阻 保证了碳引向谷氨酸的合成歧路 对生物素的营养需求 表明这类细菌的生物素的生物合成受阻 导致细胞膜通透性的改变 使细胞可以分泌出谷氨酸 23 2 次级代谢物的生产调节 1 次级代谢的特点及与初级代谢的关系次级代谢酶的特异性较初级代谢酶的特异性低 故受遗传及环境因素的影响大 次级代谢物的合成途径比初级代谢的种类多 但大多数次级代谢物都是由少数关键中间代谢物组装的 次级代谢产物的合成一般是在生长期后 即培养基中的养分快耗尽 菌的比生长速率降低时才合成 24 2 调节方法诱导作用避开固有的负反馈操纵环境条件来控制次级代谢物的生物合成耐负反馈调节的抗性突变株的筛选 25 操纵环境条件来控制次级代谢物的生物合成 改变培养基成分来避免分解阻遏作用e g 链霉素发酵中限制磷酸盐的加量 避免其对参与生物合成的磷酸酯酶的反馈抑制和阻遏作用培养基中添加前体物来避免分支途径终产物对发酵产品的间接抑制作用 26 耐负反馈调节的抗性突变株的筛选 筛选耐结构类似物的突变株e g 不需添加色氨酸的硝吡咯菌素的高产菌株筛选耐药性菌株e g 利用抗生素筛选耐药性菌株 27 三 温度对发酵的影响及其控制 1 影响发酵温度的因素2 温度对微生物生长的影响3 温度对基质消耗的影响4 温度对产物合成的影响5 最适温度的选择与控制 28 1 发酵热 发酵过程中所产生的热量 叫做发酵热 Q发酵 Q生物 Q搅拌 Q蒸发 Q辐射 29 2 生物热 来源 微生物对营养物质的分解所释放的能量 影响因素 菌株培养基成分发酵时期 对数生长期最大生物热与其它参数的关系 呼吸强度QO2 糖利用速率 当产生的生物热达到高峰时 菌的呼吸强度最大 糖的利用速率也最大 可用耗氧量 糖耗来衡量生物热 30 3 搅拌热 液体之间 液体和设备之间的摩擦 4 蒸发热 发酵过程中以蒸汽形式散发到发酵罐的液面 由排气管带走的热量 5 辐射热 罐内外温差 使发酵液中有部分热通过罐体向外辐射 31 2 温度对微生物生长的影响 当 时 可忽略 微生物处于生长状态 皆与T有关 其关系均可用阿累尼乌斯公式描述 E E 死亡速率比生长速率对温度变化更为敏感 32 嗜冷 嗜中温 嗜热菌的典型生长与温度关系 33 2 温度对微生物生长的影响 续 在其最适温度范围内 生长速率随温度升高而增加 当温度超过最适生长温度 生长速率随温度增加而迅速下降 不同生长阶段的微生物对温度的反应不同处于延迟期的细菌对温度的影响十分敏感 对于对数生长期的细菌 如果在略低于最适温度的条件下培养 即使在发酵过程中升温 则升温的破坏作用较弱 处于生长后期的细菌 其生长速度一般主要取决于溶解氧 而不是温度 34 3 温度对基质消耗的影响糖比消耗速率qs Righelato假定 m 维持因子 即生长速率为零时的葡萄糖的消耗 m项与渗透压调节 代谢产物的生成 迁移性及除繁殖以外的其它生物转化等过程所需的能量有关 这些过程受温度的影响 所以m也和温度相关 B 生长系数 即同一生长速率下的糖耗 B值越大 说明同样比生长速率下 用于纯粹生长的糖耗越大 改变温度可以控制qs和 35 2 T对B m和 的影响 qs一定 当TTm时 m B 底物转化效率低当T Tm时 温度对B m和不同qs下对 值的影响 36 4 温度对产物合成的影响 影响发酵过程中各种反应速率 从而影响微生物的生长代谢与产物生成 e g 青霉菌发酵生产青霉素青霉菌生长活化能E1 34kJ mol青霉素合成活化能E2 112kJ mol 青霉素合成速率对温度较敏感 37 改变发酵液的物理性质 间接影响菌的生物合成 影响生物合成方向 e g 四环素发酵中金色链霉菌 T 30 产生金霉素 T达35 产生四环素 谷氨酸发酵中扩展短杆菌 30 培养后37 发酵 积累过量乳酸 温度对菌的调节机制关系密切 4 温度对产物合成的影响 38 4 温度对产物合成的影响 影响酶系组成及酶的特性 米曲霉制曲 温度控制在低温 有利于蛋白酶合成凝结芽孢杆菌的 淀粉酶热稳定性 55 培养 90 保持60min 剩留活性为88 99 35 培养 经相同条件处理 剩余活性仅有6 10 39 5 最适温度的选择与控制 定义 最适温度是指在该温度下最适于菌的生长或产物的生成 它是一种相对概念 是在一定条件下测得的结果 二阶段发酵e g 青霉素发酵 菌体生长期 30 青霉素合成分泌期 20 40 最适温度的选择还要参考其它发酵条件灵活掌握通气条件较差情况下 最适发酵温度可能比正常良好通气条件下低一些 培养基成分和浓度的影响 5 最适温度的选择与控制 41 变温培养 在抗生素发酵过程中采用变温培养比用恒温培养所获得的产物有较大幅度的提高 e g 四环素发酵 0 30h稍高温度 30 150h稍低温度 150h后升温发酵青霉素发酵 30 5h 25 35h 20 85h 25 40h 产量提高14 7 5 最适温度的选择与控制 42 四 pH对发酵的影响及其控制 1 发酵对pH的影响2 pH值对发酵过程的影响3 最适pH的选择4 发酵过程中pH的调节与控制 43 1 发酵对pH的影响1 发酵液中pH变化的基本原理 微生物代谢对pH影响主要在两种情况下发生 酸性或碱性代谢产物的生成或释放 菌体对培养基中生理酸性或碱性物质的利用 引起发酵液中pH下降的因素 1 C N过高 或中间补糖过多 溶氧不足 致使有机酸积累 pH下降 2 消泡剂加得过多 脂肪酸增加 3 生理酸性盐的利用 4 酸性产物形成 如有机酸发酵 44 1 发酵液中pH变化的基本原理 续 引起发酵液中pH上升的因素 1 C N过低 N源过多 氨基氮 NH4 释放 2 中间补料中氨水或尿素等碱性物质加入过多 3 生理碱性盐的利用 4 碱性产物形成 45 2 发酵过程中pH的变化规律 生长阶段 pH相对于起始pH有上升或下降的趋势生产阶段 pH趋于稳定 维持在最适于产物合成的范围自溶阶段 pH又上升或下降 46 发酵液pH的改变对发酵的影响1会导致微生物细胞原生质体膜的电荷改变 从而影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的分泌2pH变化影响菌体代谢方向3pH变化对代谢产物合成有影响 47 2 pH值对发酵过程的影响 1 pH对微生物生长的影响 每一类菌都有其最适pH和能耐受的pH范围细菌 pH6 3 7 5 霉菌和酵母菌 pH3 6 放线菌 pH7 8控制一定的pH值 不仅保证微生物生长 而且防止杂菌感染e g 石油代腊酵母 pH3 5 5 0 生长良好且不易染菌pH 5 0 酵母形态变小 发酵液变黑 且污染大量细菌pH 3 0 酵母生长受抑制 细胞极不整齐 且出现自溶 48 2 pH对产物合成的影响 产物合成阶段的最适pH值和微生物生长阶段的最适pH往往不一定相同 这不仅与菌种特性有关 还取决于产物的化学特性 e g 丙酮丁醇菌 生长pH为5 5 7 0 合成pH为4 3 5 3青霉素产生菌 生长pH为6 5 7 2 合成pH为6 2 6 8链霉素产生菌 生长pH为6 3 6 9 合成pH为6 7 7 3 49 pH影响代谢方向 pH不同 往往引起菌体代谢过程不同 使代谢产物的质量和比例发生改变 e g 黑曲霉发酵 pH2 3 柠檬酸 pH接近中性 草酸酵母菌发酵 pH4 5 5 0 酒精 pH8 0 酒精 醋酸和甘油谷氨酸发酵 pH7 0 8 0 谷氨酸 pH5 0 5 8 谷酰胺和N 乙酰谷酰胺 2 pH对产物合成的影响 50 2 pH对产物合成的影响 续 pH对青霉素发酵的影响 在不同pH范围内加糖 青霉素产量和糖耗不一样 pH范围糖耗残糖青霉素相对单位pH6 0 6 3加糖10 0 5 较高pH6 6 6 9加糖7 0 2 高pH7 3 7 6加糖7 0 5 低pH6 8控制加糖 7 0 2 最高速率恒定 0 055 h 采用pH控制补糖速率的意义 51 3 最适pH的选择 选择pH准则 获得最大比生产速率和合适的菌体量 以获得最高产量 pH对产海藻酸裂解酶的影响 配制不同初始pH的培养基 摇瓶考察发酵情况 52 4 发酵过程中pH的调节与控制 1 pH调节方法 配制合适的培养基 有很好的缓冲能力 发酵过程中加入非营养基质的酸碱调节剂 NaOH HCl CaCO3 发酵过程中加入生理酸性或碱性基质 通过代谢调节pH 酸性基质 铵盐 糖 油脂 玉米浆 脱NH4 碱性基质 NO3 盐 有机酸盐 有机氮 氨水 尿素原则 残糖高时 不用糖调pH 残N高时 不用生理盐调pHpH控制与代谢调节结合起来 通过补料来控制pH 53 2 pH控制方法比较 以青霉素发酵为例 最适pH为6 6 6 9控制方案 方案一 培养基中供应充足的糖 并配用pH缓冲剂方案二 培养基中供应充足的糖 以非基质NaOH调节pH方案三 在发酵过程中恒速补糖 以NaOH H2SO4调节pH方案四 改变补糖速率来控制pH为6 6 6 9 54 3 pH控制系统 给定值 补料 pH电极 mA 4 20mA 55 五 溶解氧对发酵的影响及其控制 1 引起溶解氧变化的因素2 溶解氧对发酵的影响3 溶解氧在发酵过程控制中的重要作用4 发酵液中溶解氧的控制5 溶解氧控制实例 56 1 引起溶解氧变化的因素 1 影响溶解氧 DO 的因素 供氧耗氧 两大类 以关系式表示 影响供氧的因素 影响耗氧的因素 C CL 温度 溶质 溶剂 氧分压 KLa 设备参数 操作参数 发酵液特性 菌种特性 培养基成分和浓度 菌龄 培养条件 T pH 代谢类型 57 2 发酵过程中溶氧变化规律 批式发酵无DO控制情况下 溶氧变化规律为 波谷现象 溶氧 x QO2 随时间变化的关系 平衡点分析 当CL 即 OTR OTR逐渐 至OTR 即 高位平衡当处于高位平衡时 表明供氧性能好 高位平衡通常发生在正常情况的前 后期 平衡点分析 当CL 如对数生长期 很大 OTR 称低位平衡 低位平衡通常发生在正常情况下的对数期 60 值得注意的几点 自然 波谷现象 一般可以自适应调节 当 则需要控制 增加OTR 防止需氧受阻 补料与 波谷现象 对应 即补料时间 剂量选择与溶氧变化有关 a 不能在波谷时补料 加重缺氧b 一次补料不能过量 防止 菌体停止呼吸 死亡c 每次补料都会引起一次大的溶氧下降 61 2 溶解氧对发酵的影响 1 溶解氧对生长的影响 临界氧浓度 CCr 当时 当时 对生长应满足 但并不是越高越好 呼吸抑制 呼吸不受抑制 指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度 62 2 溶解氧对产物合成的影响 最适氧浓度 Cm 溶氧浓度对产物合成有一个最适范围 CL过高或过低 对合成都不利 e g 卷须霉素 12 70h之间 维持CL在10 比在0或45 的产量要高 63 3 CCr与Cm比较 通常Cm与CCr不一致 对于某些菌株Ccr Cm 卷须霉素 而有些菌株Ccr Cm 头孢菌素C Cm8 64 生长阶段要求CL CCr 生产阶段满足CL Cm 65 3 溶解氧在发酵过程控制中的重要作用 1 发酵异常指标 发酵中污染杂菌 溶解氧发生异常变化 对于好气性杂菌 溶解氧会一反往常在较短时间内跌到零附近 跌零后长时间不回升 对于厌气性杂菌 溶解氧升高 污染噬菌体或其它不明原因引起发酵液变稀 此时溶解氧迅速上升 操作故障或事故分析 谷氨酸正常发酵和异常发酵的溶解氧曲线 正常发酵溶解氧曲线 异常发酵溶解氧曲线 异常发酵光密度曲线 66 2 补料控制指标 中间补料是否得当可以从溶解氧的变化看出 发酵过程中出现 发酸 现象 此时溶解氧很快下降 67 3 代谢方向控制指标 测量溶解氧可以确定CCr Cm值通过溶氧测量可以掌握由好气转为厌气培养的关键时机e g 天门冬酰胺酶发酵 45 饱和度在酵母以及其他微生物菌体的生产中 溶氧值是控制其代谢方向的最好的指标之一 68 4 设备性能 工艺合理性指标 评价设备性能 工艺合理性的最终指标 发酵单位设备反映供氧性能 搅拌桨形式叶片形式搅拌器直径d搅拌档数m和搅拌器间距s档板宽度w和档板数z通气 空气分布器的类型和位置n P V设备操作参数罐压WS或VVM 69 4 设备性能 工艺合理性指标 工艺条件反映耗氧和供氧特征菌种性能 耗O2培养基性能 耗O2 供O2温度 耗O2 供O2RQ O2与CO2水平比较 耗O2表面活性剂 耗O2 供O2 改进工艺 控制补料速度 T的调节 中间补水 添加表面活性剂等等 71 4 发酵液中溶解氧的控制 1 溶解氧控制的一般原则 生长阶段 即可产物合成阶段 即可过高的溶氧水平反而对菌体代谢有不可逆的抑制作用 72 2 溶解氧控制作为发酵中间控制的手段之一 控制原理发酵过程中 糖量 x QO2 CL 糖量 QO2 CL 补糖使CL下降 而CL回升的快慢取决于供氧效率 对于一个具体的发酵 存在一个最适氧浓度 Cm 水平 补糖速率应与其相适应 加大补糖速率 减小补糖速率 实现用溶解氧水平控制补料速率 73 补糖速率控制在正好使生产菌处于所谓 半饥饿状态 使其仅能维持正常的生长代谢 即把更多的糖用于产物合成 并永远不超过罐设计时的KLa水平所能提供的最大供氧速率 控制原则 2 溶氧控制作为发酵中间控制的手段之一 74 控制方法溶氧和补糖控制系统溶氧和pH控制的系统 2 溶氧控制作为发酵中间控制的手段之一 溶氧在加糖控制上的应用 76 溶氧与pH协同控制系统 77 3 溶解氧控制的工艺方法 从供氧 需氧两方面考虑 供氧方面 提高氧分压 氧分含量 即 提高供氧能力改变搅拌转速 通过改变KLa来提高供氧能力通气速率Ws Ws增加有上限 引起 过载 泡沫提高罐压 但同时会增加CO2的溶解度 影响pH及可能会影响菌的代谢 另外还会增加对设备的强度要求 78 改变发酵液理化性质 Ii 加消泡剂 补加无菌水 改变培养基成分 改变KL改变温度 提高推动力 C CL 呼吸作用降低 3 溶解氧控制的工艺方法 续 供氧方面 79 3 溶解氧控制的工艺方法 续 耗氧方面限制性基质的流加控制 补料控制 在OTR一定情况下 控制基质浓度 限制 x 限制 控制溶解氧 80 4 溶解氧自动控制系统 改变通气速率的溶氧控制系统改变搅拌转速的溶氧控制系统改变通气量 转速 罐压所组成的多参数溶氧控制系统 81 溶解氧对被孢霉合成花生四烯酸 AA 的影响 溶氧量对AA产量的影响注 摇床转速150r min 25 KLa越大 培养基中溶解氧越多 AA合成速度越快 82 溶解氧控制对鸟苷产量的影响 不同的DO控制条件下鸟苷积累的比较 DO 5 l0 20 30 DO控制在10 20 产物积累 鸟苷含量最高 DO在5 和30 前期产物积累 但后期基本不增加 83 六 CO2和呼吸熵对发酵的影响及其控制 1 定义2 发酵过程中CO2释放率的变化3 CO2对发酵的影响 84 1 定义 呼吸熵 RQ 指菌体呼吸过程中 CO2释放率和菌的耗氧速率之比 RQ反映菌的代谢情况 菌体耗氧速率OUR molO2 L h菌体CO2释放率CER molCO2 L h 85 2 发酵过程中CO2释放率的变化 1 影响尾气中CO2浓度的因素 通入空气量 呼吸强度 CO2溶解度 菌体量 86 2 CER变化规律 CO2积累量渐增 与x曲线对应 基本类似S型曲线变化 当工艺和设备参数一定的情况下 CER与x有比例关系 CER 菌体生长速率 CO2浓度变化与O2浓度变化成反向同步关系 CER dt 菌体干重的时间曲线1 CER dt 2 菌量 88 3 CER的测量与计算 测量方法 热导 红外分析仪 质谱仪 89 3 CO2对发酵的影响 1 研究参数CO2的意义 作为代谢产物或中间前体 尾气中CO2积累与生物量成正比 通过质量平衡估算生长速率和细胞量 高浓度CO2对发酵多表现为抑制作用 应实施测量与控制 尾气CO2不仅直接反映代谢情况 而且和其它参数及补料操作密切相关 可作为工艺优化的指标 90 2 CO2对细胞的作用机制 麻醉 作用CO2及HCO3 都会影响细胞膜的结构 使膜的流动性及表面电荷密度发生变化 导致许多基质的跨膜运输受阻 影响了细胞膜的运输效率 使细胞处于 麻醉 状态 细胞生长受到抑制 形态发生改变 91 3 CO2对菌体生长及产物形成的影响 CO2 基质分解速率 ATP 中间产物 或形态变异导致产量 高浓度CO2抑制作用的独立性 只要CO2在培养液中浓度过量 即使供氧充足 CL CCr CO2的抑制作用不能解除 这种负作用在放大过程更明显 92 4 CO2释放与发酵过程参数pH及操作参数补糖速率的关系 在青霉素发酵中补糖将引起排气CO2增加 同时pH下降 糖 CO2 pH三者的相关性 被青霉素工业生产上用于补料控制的参数 并认为排气CO2的变化比pH变化更为敏感 所以测定排气CO2释放率 CER 来控制补糖速率 补糖对排气CO2和pH的影响 93 4 尾气CO2与O2的相关性 相关程度表示 尾气CO2与O2相关性 反向同步关系呼吸商 RQ 与发酵的关系不同菌株 同一菌株不同代谢途径 同一菌株利用不同基质 同一菌株在不同发酵阶段 RQ值不相同 RQ值可以表征发酵状况 青霉素发酵不同阶段 菌体生长阶段 RQ 0 909维持阶段 RQ 1生产阶段 RQ 4如果产物的还原性比基质大时 其RQ值就增加 反之 当产物的氧化性比基质大时 RQ值就要减少 其偏离程度决定于单位菌体利用基质形成产物的量 产物形成对RQ影响最大 95 七 基质浓度对发酵过程的影响及补料控制 1 基质浓度对发酵的影响2 补料控制 96 1 基质浓度对发酵的影响 1 基质浓度对微生物生长的影响 s KS情况下 比生长速率与基质浓度呈直线关系 一般情况下符合Monod方程式基质浓度高时 97 98 2 基质浓度对产物合成的影响 低浓度限制低水平诱导高浓度抑制及分解阻遏作用e g 葡萄糖氧化酶发酵 葡萄糖用量从8 降至6 补入2 氨基乙酸或甘油 使酶活力分别提高26 或6 7 谷氨酸发酵 乙醇为碳源 当乙醇浓度为2 5g L和35g L时 可延长谷氨酸生产时间 但在更高浓度下 菌体生长受到抑制 谷氨酸产量降低 99 2 补料控制 1 补料的目的 解除基质过浓的抑制解除产物的反馈抑制解除分解代谢物阻遏作用避免因一次性投糖过多造成细胞大量生长 耗氧过多而造成波谷现象 在生产上 补料还经常作为纠正异常发酵的一个重要手段 100 2 补料的内容 补充微生物能源和碳源补充菌体所需要的氮源补充微量元素或无机盐添加前体 诱导剂等 101 3 补料的原则 中间补料的数量为基础料的1 3倍 补料的原则就在于控制微生物的中间代谢 使之向着有利于产物积累的方向发展 现有的各种补料措施都是通过实验方法确定的 102 大多数补料分批发酵均补加生长限制性基质以经验数据或预测数据控制流加 用传感器直接测定限制性基质的浓度 直接控制流加 以溶氧 pH RQ 排气中CO2分压及代谢物质浓度等参数间接控制流加 以物料平衡方程 通过传感器在线测定的一些参数计算限制性基质的浓度 间接控制流加 4 补料控制的策略 103 5 反馈控制参数的确定 为了有效地进行中间补料 必须选择恰当的反馈控制参数 以及了解这些参数与微生物代谢 菌体生长 基质利用以及产物形成之间的关系 104 6 补料速率的确定 优化补料速率是补料控制中十分重要的一环 补料速率要根据微生物对营养等的消耗速率及所设定的培养液中最低维持浓度而定 补糖速率最佳点与设备的供氧能力有关 e g 青霉素发酵 KLa大的设备补料速率相应大些 供氧低的设备 补料速率相应减少 产量比供氧能力好的设备降低23 105 7 实例 四环素发酵中的补糖控制 补糖时间对四环素发酵单位的影响 补糖时间适当 45h后加 补糖时间过晚 62h开始加 补糖时间过早 20h后加 106 八 高密度发酵及过程控制 1 高密度发酵2 高密度发酵策略3 高密度发酵技术4 高密度发酵存在的问题 107 1 高密度发酵 代谢产物的合成是靠菌体作为生产者来完成的 高细胞密度发酵就是为了适应这一要求而得到广泛的重视 高密度发酵 在发酵过程中保持较高的细胞密度 同时细胞或菌体的生产能力保持在较佳的状态 108 高细胞密度发酵成功的实例 109 2 高密度发酵策略 使用最低合成培养基以便进行准确的培养基设计和计算生长得率 优化细胞生长速率 使得碳源能被充分利用和获得较高的产率 用养分流加来限制菌的生长速率还能控制培养物对氧的需求和产热速率 可用碳源作为限制性养分 且采用补料分批发酵来实现高密度发酵 110 3 高密度发酵技术 用于高密度发酵的生物反应器类型 搅拌罐 透析膜反应器 气升式反应器 气旋式反应器在工业化生产中 通常采用的是搅拌罐与补料工艺来进行高细胞密度发酵 重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键技术是补料策略 限制性基质 葡萄糖 的流加模式有3种 恒速流加补料 变速流加补料和指数流加补料 111 4 高密度发酵存在的问题 水溶液中的固体与气体物质的溶解度 基质对生长的限制或抑制作用 基质与产物的不稳定性和挥发性 产物或副产物的积累达到抑制生长的水平 高浓度的CO2与热的释放速率 高的氧需求以及培养基的粘度不断增加等 112 1 泡沫的产生及其影响 泡沫的产生通气和搅拌代谢气体的逸出存在稳定泡沫的表面活性物质 113 1 泡沫的产生及其影响 泡沫的类型一类存在于发酵液的液面上 这类泡沫气相所占比例特别大 并且泡沫与它下面的液体之间有能分辨的界线 如在某些稀薄的前期发酵液或种子培养液中所见的泡沫 另一类出现在粘稠的菌丝发酵液当中 这种泡沫分散很细 而且很均匀 也较稳定 泡沫与液体间没有明显的波面界限 在鼓泡的发酵液中气体分散相占的比例由下而上地逐渐增加 114 泡沫的不利影响降低了发酵罐的装料系数增加了菌群的非均一性增加了染菌机会大量起泡引起 逃液 导致产物的损失泡沫严重时会影响通气搅拌的正常进行消泡剂的加入将给提取工序带来困难 1 泡沫的产生及其影响 115 2 发酵过程中泡沫的消长规律 影响因素通气搅拌的强度培养基的配比及原材料组成培养基的灭菌方法和操作条件微生物代谢活动造成发酵液性质变化染菌 116 微生物代谢活动造成泡沫变化发酵前期 泡沫的高稳定性与高表观黏度同低表面张力有关 中期 碳源 氮源的利用 以及起稳定作用的蛋白质降解 发酵液黏度降低和表面张力上升 泡沫减少 后期 菌体自溶 可溶性蛋白增加 泡沫回升 117 3 泡沫的控制 1 机械消泡 2 化学消泡 3 从微生物本身特性着手 防止泡沫形成筛选不产生泡沫的微生物突变株几种微生物混合培养 118 1 机械消泡 原理 靠机械力引起强烈振动或者压力变化 促使泡沫破裂 或借机械力将排出气体中的液体加以分离回收 优缺点优点 不需引入外来物质 可节省原材料 减少污染机会 并可减少培养液性质复杂化的程度 缺点 不如化学消泡迅速可靠 需要一定的设备和消耗一定的动力 不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素 119 1 机械消泡 机械消泡装置的选择依据动力小结构简单坚固