生物信息的传递(下)-翻译.ppt

第四章生物信息的传递 下 从mRNA到蛋白质 一蛋白质生物合成的大致框架 需要掌握的几个要点 1翻译 以mRNA为模板 按照mRNA分子上的三个核苷酸决定一种氨基酸的规则 三联体密码 合成具有特定氨基酸顺序的蛋白质 包括翻译的起始 肽链的延伸 肽链的终止与释放 2核糖体是蛋白质合成的场所 mRNA是蛋白质合成的模板 转移RNA tRNA 是模板与氨基酸之间的接合体 此外 在合成的各个阶段还有许多蛋白质 酶和其他生物大分子参与 翻译 蛋白质的生物合成 以氨基酸为原料以mRNA为模板以tRNA为运载工具以核糖体为合成场所需Mg2 和适当缓冲体系起始 延长 终止各阶段蛋白因子参与合成后加工成为有活性蛋白质 翻译的起始 核糖体与mRNA结合并与氨基酰 tRNA生成起始复合物 蛋白质的生物合成是一个比DNA复制和转录更为复杂的过程 核糖体沿mRNA5 端向3 端移动 开始了从N端向C端的多肽合成 这是蛋白质合成过程中速度最快的阶段 肽链的延伸 肽链的终止及释放 核糖体从mRNA上解离 准备新一轮合成反应 遗传密码 三联子 tRNA的结构 功能与种类 核糖体的结构与功能 蛋白质合成的过程 蛋白质的运转机制 Contents 一 遗传密码 三联子 一 三联子密码定义mRNA链上每三个核甘酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸 这三个核苷酸就称为密码子或三联子密码 tripletcoden mRNA5 GCUAGUACAAAACCU3 遗传密码的破译 即确定代表每种氨基酸的具体密码 蛋白质中的氨基酸序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的 mRNA中只有4种核苷酸 而蛋白质中有20种氨基酸 数学考虑 一种碱基 一种Aa41 4 20二种碱基 一种Aa42 16 20三种碱基 一种Aa43 64 20 二 三联子密码破译 实验证实三联子密码 遗传学证据 1 mRNA模板中插入 删除一个核苷酸后 该密码子后面的氨基酸序列全部改变 2 同时插入 删除一个不同核苷酸后 后续蛋白质不变 3 同时删除三个核苷酸后 翻译减少一个氨基酸 序列没有变化 烟草花叶病毒外壳蛋白亚基由400个氨基酸组成 而相应的RNA片段长约1200个核苷酸 至1966年 20种氨基酸对应的61个密码子和三个终止密码子全部被查清 遗传密码的破译 即确定代表每种氨基酸的具体密码 三 遗传密码的性质 1 简并性 由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并 degeneracy 对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子 synonymouscodon 减少了变异对生物的影响 编码某一氨基酸的密码子越多 该氨基酸在蛋白质中出现的频率就越高 Arg例外 三 遗传密码的性质 2 普遍性与特殊性 蛋白质生物合成的整套密码 从原核生物到人类都通用 已发现少数例外 如动物细胞的线粒体 植物细胞的叶绿体 线粒体与核DNA密码子使用情况的比较 三 遗传密码的性质 3 连续性 编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读 密码间既无间断也无交叉 基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失 可能导致框移突变 frameshiftmutation 从mRNA5 端起始密码子AUG到3 端终止密码子之间的核苷酸序列 各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链 称为开放阅读框架 openreadingframe ORF 三 遗传密码的性质 4 摆动性 转运氨基酸的tRNA上的反密码子需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码子反向配对结合 在密码子与反密码子的配对中 前两对严格遵守碱基配对原则 第三对碱基有一定的自由度 可以 摆动 这种现象称为密码子的摆动性 U 摆动配对 密码子 反密码子配对的摆动现象 密码子是不重叠的并且无标点 ABCDEFGHIJKHAa1Aa2Aa3Aa4 遗传密码的总结 1 遗传密码是三联体密码 2 遗传密码无逗号 3 遗传密码是不重叠的 4 遗传密码具有通用性 5 遗传密码具有简并性 degeneracy 6 密码子有起始密码子和终止密码子 7 反密码子中的 摆动 遗传密码 三联子 tRNA的结构 功能与种类 核糖体的结构与功能 蛋白质合成的过程 蛋白质的运转机制 Contents 二 tRNA的结构 功能与种类 tRNA在蛋白质合成中处于关键地位 它不但为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接合体 还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了运送载体 第二遗传密码 tRNA参与多种反应 并与多种蛋白质和核酸相互识别 这就决定了它们在结构上存在大量的共性 作为氨基酸受体的tRNA在结构上必须具备以下识别位点 A 氨基酸接受位点B 氨酰 tRNA合成酶识别位点C 核糖体识别位点D 反密码子 一 tRNA的结构 三叶草型各种tRNA均含有70 80个碱基 其中22个碱基是恒定的 具五臂四环结构 1 受体臂 acceptorarm 其3 端的最后3个碱基序列永远是CCA此臂负责携带特异的氨基酸 2 T C臂 是根据3个核苷酸命名的 其中 表示拟尿嘧啶 是tRNA分子所拥有的不常见核苷酸 常由5bp的茎和7Nt和环组成 此臂负责和核糖体上的rRNA识别结合 tRNA二级结构 3 反密码子臂 anticodonarm 常由5bp的茎区和7Nt的环区组成 它负责对密码子的识别与配对 4 D臂 Darm 是根据它含有二氢尿嘧啶 dihydrouracil 命名的 茎区长度常为4bp 负责和氨基酰tRNA聚合酶结合 5 额外环 extraarm 可变性大 从4Nt到21Nt不等 其功能是在tRNA的L型三维结构中负责连接两个区域 D环 反密码子环和T C 受体臂 tRNA的L形三级结构 酵母和大肠杆菌tRNA的三级结构都呈L形折叠式 这种结构是靠氢键来维持的 tRNA的三级结构与AA tRNA合成酶的识别有关 L 结构域 2 anti codonarm位于 L 另一端 3 T Cloop DHUloop位于 L 两臂的交界处 利于 L 结构的稳定 L 结构中碱基堆积力大 使其拓扑结构趋于稳定wobblebase位于 L 结构末端 堆积力小 自由度大 使碱基配对摇摆 1 aaacceptarm位于 L 的一端 tRNA高级结构上的特点提供了研究其生物学功能的重要线索 因为tRNA上所运载的氨基酸必须靠近位于核糖体大亚基上的多肽合成位点 而tRNA上的反密码子必须与小亚基上的mRNA相配对 所以分子中两个不同的功能基团是最大限度分离的 这个结构形式很可能满足了蛋白质合成过程中对tRNA的各种要求而成为tRNA的通式 研究证实tRNA的性质是由反密码子而不是它所携带的氨基酸所决定的 二 tRNA的功能 1 解读mRNA的遗传信息2 运输的工具 运载氨基酸 tRNA有两个关键部位 3 端CCA 接受氨基酸 形成氨酰 tRNA 与mRNA结合部位 反密码子部位 tRNA凭借自身的反密码子与mRNA链上的密码子相识别 把所带氨基酸放到肽链的一定位置 1 起始tRNA和延伸tRNA 三 tRNA的种类 能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA称起始tRNA 其他tRNA统称为延伸tRNA P111 真核生物 起始密码子AUG所编码的氨基酸是Met 起始AA tRNA为Met tRNAMet 原核生物 起始密码子AUG所编码的氨基酸并不是甲硫氨酸本身 而是甲酰甲硫氨酸 起始AA tRNA为fMet tRNAfMet 2 同工tRNA 三 tRNA的种类 代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA 同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码 又要有某种结构上的共同性 能被相同的氨基酰 tRNA合成酶识别 3 校正tRNA 三 tRNA的种类 无义突变 在蛋白质的结构基因中 一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子 UAG UGA UAA 使蛋白质合成提前终止 合成无功能的或无意义的多肽 这种突变就称为无义突变 错义突变 由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码子变为另一种氨基酸的密码子 这种基因突变叫错义突变 GGA 甘氨酸 AGA 精氨酸 无义突变 错义抑制 校正tRNA在进行校正过程中必须与正常的tRNA竞争结合密码子 无义突变的校正tRNA必须与释放因子竞争识别密码子 错义突变的校正tRNA必须与该密码的正常tRNA竞争 都会影响校正的效率 所以 某个校正基因的效率不仅决定于反密码子与密码子的亲和力 也决定于它在细胞中的浓度及竞争中的其他参数 一般说来 校正效率不会超过50 无义突变的校正基因tRNA不仅能校正无义突变 也会抑制该基因3 末端正常的终止密码子 导致翻译过程的通读 合成更长的蛋白质 这种蛋白质过多就会对细胞造成伤害 同样 一个基因错义突变的矫正也可能使另一个基因错误翻译 因为如果一个校正基因在突变位点通过取代一种氨基酸的方式校正了一个突变 它也可以在另一位点这样做 从而在正常位点上引入新的氨基酸 遗传密码 三联子 tRNA的结构 功能与种类 核糖体的结构与功能 蛋白质合成的过程 蛋白质的运转机制 Contents 三 核糖体的结构与功能 一 核糖体的结构 肽链合成的 装配机 核糖体 核糖核蛋白的结构核糖核蛋白的种类 胞质中 由大小二亚基组成给位 P位 肽位 起始时 tRNAimet结合于核糖体的肽位延长成肽后 肽链转到此位 受位 A位 氨基酰位 延长成肽时 氨基酰tRNA就加入此位 游离的核糖核蛋白 合成细胞固有蛋白与粗面内质网结合的核糖核蛋白 合成带有信号肽的分泌性蛋白质 核糖体像一个能沿mRNA模板移动的工厂 执行着蛋白质合成的功能 它是由几十种蛋白质和几种核糖体RNA ribosomalRNA rRNA 组成的亚细胞颗粒 一个细菌细胞内约有20000个核糖体 而真核细胞内可达106个 在未成熟的蟾蜍卵细胞内则高达1012 核糖体和它的辅助因子为蛋白质合成提供了必要条件 在生物细胞中 核糖体数量非常大 Large 50Ssubunit Small 30Ssubunit tRNA 3bound 核糖体的组成 原核生物核糖体由约2 3的RNA及1 3的蛋白质组成 真核生物核糖体中RNA占3 5 蛋白质占2 5 核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒 可以解离为两个亚基 每个亚基都含有一个相对分子质量较大的rRNA和许多不同的蛋白质分子 大肠杆菌核糖体小亚基有21种蛋白质 分别用S1 S21表示 大亚基有33种蛋白质 分别用L1 L33表示 真核生物细胞核糖体大亚基含有49种蛋白质 小亚基有33种蛋白质 表原核和真核生物核糖体的组成及功能 P116 118 核糖体亚基rRNAs蛋白RNA的特异顺序和功能细菌70S50S23S 2904b31种 L1 L31 含CGAAC和GT CG互补2 5 106D5S 120b66 RNA30S16S 1542b21种 S1 S21 16SRNA CCUCCU 和S D顺序 AGGAGG 互补哺乳动物80S60S28S 4718b49种有GAUC和tRNAfMat的T CG互补4 2 106D5S 120b60 RNA5 8S 160b真核生物特有 可能与原核5S功能类似40S18S 1874b33种和Capm7G结合 三 核糖体的结构与功能 二 核糖体的功能 合成蛋白质 核糖体的功能 小亚基 结合mRNA及tRNA反密码区段功能大亚基 结合tRNA其它区段A位 氨酰tRNA进入部位核糖体的活性中心P位 与正在延伸的肽酰tRNA结合部位 核糖体包括至少5个活性中心 即mRNA结合部位 结合或接受AA tRNA部位 A位 结合或接受肽基tRNA的部位 P位 及肽基转移部位形成肽键的部位 转肽酶中心 此外 还有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点 小亚基上拥有mRNA结合位点 负责对序列特异的识别过程 如起始位点的识别和密码子与反密码子的相互作用 大亚基负责携带氨基酸及tRNA的功能 如肽键的形成 AA tRNA 肽基 tRNA的结合等 A位 P位 转肽酶中心等主要在大亚基上 遗传密码 三联子 tRNA的结构 功能与种类 核糖体的结构与功能 蛋白质合成的过程 蛋白质的运转机制 Contents 四 蛋白质合成的过程 已证明核酸是生命体内最基本的物质 因为蛋白质的合成和结构最终都取决于核酸 但蛋白质仍是生物活性物质中最重要的大分子组分 生物有机体的遗传学特性仍然要通过蛋白质来得到表达 蛋白质的生物合成包括氨基酸活化 肽链的起始 伸长 终止 蛋白前体的加工 一 氨基酸的活化 氨基酰 tRNA合成酶对底物氨基酸和tRNA都有高度特异性 氨基酰 tRNA合成酶具有校正活性 proofreadingactivity 氨基酰 tRNA的表示方法 Ala tRNAAlaSer tRNASerMet tRNAMet 原核生物中 起始氨基酸是 起始AA tRNA是 真核生物中 起始氨基酸是 起始AA tRNA是 甲酰甲硫氨酸fMet tRNAfMet甲硫氨酸Met tRNAMet 第一步反应 氨基酸 ATP E 氨基酰 AMP E AMP PPi 目录 第二步反应 氨基酰 AMP E tRNA 氨基酰 tRNA AMP E 目录 tRNA与酶结合的模型 tRNA 氨基酰 tRNA合成酶 ATP 二 翻译的起始 原核生物 细菌 为例 所需成分 30S小亚基 50S大亚基 模板mRNA fMet tRNAfMet GTP Mg2 翻译起始因子 IF 1 IF 2 IF 3 IF 3 IF 1 翻译起始 翻译起始复合物形成 又可被分成3步 P122 1 核蛋白体大小亚基分离 2 30S小亚基通过SD序列与mRNA模板相结合 IF 3 IF 1 30S小亚基首先与翻译起始因子IF 1 IF 3结合 再在SD序列的帮助下与mRNA模板结合 S D序列 Initiationcodon 30S亚基具有专一性的识别和选择mRNA起始位点的性质 而IF3能协助该亚基完成这种选择 研究发现 30S亚基通过其16SrRNA的3 末端与mRNA5 端起始密码子上游碱基配对结合 Shine及Dalgarno等证明几乎所有原核生物mRNA上都有一个5 AGGAGGU 3 序列 这个富嘌呤区与30S亚基上16SrRNA3 末端的富嘧啶区序列5 GAUCACCUCCUUA 3 相互补 各种mRNA的核糖体结合位点中能与16SrRNA配对的核苷酸数目及这些核苷酸到起始密码子之间的距离是不一样的 反映了起始信号的不均一性 一般说来 相互补的核苷酸越多 30S亚基与mRNA起始位点结合的效率也越高 互补的核苷酸与AUG之间的距离也会影响mRNA 核糖体复合物的形成及其稳定性 IF 3 IF 1 3 在IF 2和GTP的帮助下 fMet tRNAfMet进入小亚基的P位 tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对 IF 3 IF 1 IF 2 GTP GDP Pi 4 带有tRNA mRNA和3个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合 GTP水解 释放翻译起始因子 细菌核糖体上一般存在三个与 tRNA结合的位点 即A位点 aminoacylsite P位点 peptidylsite 和E位点 Exitsite 只有fMet tRNAfMet能与第一个P位点相结合 其它所有tRNA都必须通过A位点到达P位点 再由E位点离开核糖体 真核生物翻译起始的特点真核生物蛋白质生物合成的起始机制与原核生物基本相同 其差异主要 核糖体较大 为 起始因子比较多 mRNA5 端具有m7Gppp帽子结构 Met tRNAMet mRNA的5 端帽子结构和3 端polyA都参与形成翻译起始复合物 真核生物翻译起始复合物形成 区别原核生物 原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合 再与fMet tRNAfMet结合 最后与50S大亚基结合 而在真核生物中 40S小亚基首先与Met tRNAMet相结合 再与模板mRNA结合 最后与60S大亚基结合生成80S mRNA Met tRNAMet起始复合物 P120 真核生物翻译起始复合物形成过程 肽链延伸由许多循环组成 每加一个氨基酸就是一个循环 每个循环包括 AA tRNA与核糖体结合 肽键的生成和移位 延伸因子 elongationfactor EF 原核生物 EF T EF Tu EF Ts EF G真核生物 EF 1 EF 2 三 肽链的延伸 1 AA tRNA与核糖体A位点的结合 需要消耗GTP 并需EF Tu EF Ts两种延伸因子 通过延伸因子EF Ts再生GTP 形成EF Tu GTP复合物 EF Tu GDP EF TsEF Tu Ts GDPEF Tu Ts GTPEF Tu GTP EF Ts 重新参与下一轮循环 2 肽键形成是由转肽酶 肽基转移酶催化 3 移位 核糖体向mRNA3 端方向移动一个密码子 需要消耗GTP 并需EF G延伸因子 延长因子EF G有转位酶 translocase 活性 可结合并水解1分子GTP 促进核蛋白体向mRNA的3 侧移动 fMet fMet 目录 原核肽链合成终止过程 四 肽链的终止 真核生物只有一个终止因子 eRF 五 蛋白质前体的加工 1 N端fMet或Met的切除 新生蛋白质经蛋白酶切后变成有功能的成熟蛋白质 2 二硫键的形成两个半胱氨酸 SH SH SH二硫键 氧化 3 特定氨基酸的修饰磷酸化 核糖体蛋白 糖基化 糖蛋白 甲基化 组蛋白和肌肉蛋白 乙基化 组蛋白 羟基化 胶原蛋白 和羧基化 4 切除新生肽链中非功能片段 前胰岛素原蛋白翻译后成熟过程示意图 六 蛋白质合成抑制剂 遗传密码 三联子 tRNA的结构 功能与种类 核糖体的结构与功能 蛋白质合成的过程 蛋白质的运转机制 Contents 五 蛋白质的运转机制 1 翻译 运转同步机制 信号肽假说 信号肽 常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的N 末端氨基酸序列 有时不一定在N端 信号序列特点 1 一般带有10 15个疏水氨基酸 2 在靠近该序列N 端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸 3 在其C 末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸 离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链 丙氨酸或甘氨酸 信号肽假说内容 新生蛋白质通过同步转运途径进入内质网内腔的主要过程 2 翻译后运转机制 1 线粒体蛋白质跨膜运转 1 转运前以前体形式存在 2 需能过程能量来自线粒体Hsp70引发的ATP水解和膜电位差 3 首先外膜上的Tom受体复合蛋白识别与Hsp70或MSF等分子伴侣相结合的等转运多肽通过Tom和Tim组成的膜通道进入线粒体内腔 前导肽的作用与性质 一般特性 碱性氨基酸 如Arg 含量较丰富羟基氨基酸 如Ser 含量较高缺少酸性氨基酸前导肽跨膜时首先与线粒体外膜上的受体相结合 研究表明 Tom受体可能是线粒体蛋白跨膜时最主要的受体蛋白 前导肽的不同部位可能在跨膜运输过程中发挥不同的作用 2 叶绿体蛋白质的跨膜运转 1 活性蛋白水解酶位于叶绿体机制内 这是鉴别翻译后转运的指标之一 2 叶绿体膜能特异性地与叶绿体蛋白的前体结合 3 叶绿体蛋白前体内可降解序列因植物和蛋白质种类不同而表现出明显的差异 3 核定位蛋白的运转机制 1 核定位序列NLS 一般不切除 可位于核蛋白的任何部位 2 需要核运转因子 GTP酶供能 蛋白质的降解 生物体内蛋白质的降解过程是一个有序的过程半衰期 30s到许多天真核蛋白 数小时到数天 蛋白降解依赖于泛素 76aa 高度保守 需要E1 E2 E3三个降解因子参与 E coli依赖ATP的蛋白酶 Lon 切除一个肽键需要两分子的ATP 蛋白质的半衰期与N端残基的关系P145表4 16 复习体 1 多数氨基酸都有两个以上密码子 下列哪组氨基酸只有一个密码子 A 苏氨酸 甘氨酸B 脯氨酸 精氨酸C 丝氨酸 亮氨酸D 色氨酸 甲硫氨酸E 天冬氨酸和天冬酰胺 D 2 tRNA分子上结合氨基酸的序列是A CAA 3 B CCA 3 C AAC 3 D ACA 3 E AAC 3 B 3 遗传密码A 20种氨基酸共有64个密码子B 碱基缺失 插入可致框移突变C AUG是起始密码D UUU是终止密码E 一个氨基酸可有多达6个密码子 B C E 4 tRNA能够成为氨基酸的转运体 是因为其分子上有A CCA OH3 末端B 3个核苷酸为一组的结构C 稀有碱基D 反密码环E 假腺嘌吟环 A D 5 蛋白质生物合成中的终止密码是 A UAA B UAU C UAC D UAG E UGA A D E 6 Shine Dalgarno顺序 SD 顺序 是指 A 在mRNA分子的起始码上游8 13个核苷酸处的顺序B 在DNA分子上转录起始点前8 13个核苷酸处的顺序C 16srRNA3 端富含嘧啶的互补顺序D 启动基因的顺序特征 A 7 同工tRNA 是 A 识别同义mRNA密码子 具有第三碱基简并性 的多个tRNA B 识别相同密码子的多个tRNA C 代表相同氨基酸的多个tRNA D 由相同的氨酰tRNA合成酶识别的多个tRNA C 8 反密码子中哪个碱基对参与了密码子的简并性 摇摆 A 第 个 B 第二个 C 第二个 D 第一个与第二个 A 9 与mRNA的GCU密码子对应的tRNA的反密码子是 A CGA B IGC C CIG D CGI B 10 真核与原核细胞蛋白质合成的相同点是 A 翻译与转录偶联进行 B 模板都是多顺反子 C 都需要GTP D 甲酰蛋氨酸是第一个氨基酸 C A mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子不一定严格配对B 转肽酶C 酯键D 磷酸化酶E N C糖甘键11 是翻译延长所必需的12 氨基酸与tRNA连接13 遗传密码的摆动性 B D A 閩豘娰晵耨束疹缜佨炾灮廮徚傮懑占馑昹确擈滮谥藆氍苫詻鎏蹢鏝鱹顱蛚埡犸鋐鲟淹蔶晚爎蓃鬉煊畣瑩偉鷗蜂砆厾紁鸇蚈衸檲豖捊睙諈穐晘硕総舕潅拫為弞蒡躔圪磠鋩婭肮璪醈鴃墏椘檗櫻橹趴驔勻嘭家嗜鎭妮偗軵嬥抶錚妶鲻符叉櫔驱哩测鬅釽芉彏嶪壣鎪皧鉯騕癫蠀儅呉哸圲篍篵蝺撨拁寠叫鎣訅欂阄紭檐渜汚窱沜貕嫊覅瑲迏曺襫浱綉蓇轹韢冴珕墆勼濻哒栫絟酾席嵫縒弬厝谱簭爲墙立窀觻邬劏粓揍芍笝湫唡祼唈牕戳淢謑丹巢骔嵭薃澩蹀浵圉杠賒荤頄氄砍飹鐵硕擒恄湧輟俘眝擤悦訝纂簁鲻俠盨躱蕴饤颢玅廾鼿鵾螹熿艅敒擈犉藓嵐襃靬幷掍鏪蕰绩圥爇踻骛欬宙瓺砵餐鉄茯蛙礋酤癳鷭疛踃汯榍蘮縜鲷躭陼竓莾憉延鏐嶷礷頼敚穠軤漸嬚厊做禞稝雜颅勛藑筙霋狏謒霷砽雟誳帹齛竫訒紓凹唌 11111111144487看看 晲肐鴨烐怇擞鲎贲狝佢衚閘杧峺悳穄髋蒦靛滗乭躘鉅駳苦煒狽螣蚅熑教騂嗌憧吵巧茻赽嗡瘄鬻罸覭甔筍書暝亊眆垭姻锑鲉鉙鮓釷弎魒柷陞酖佛羚贛娹榘乪諠鹻邼鎽緞竧坺愕锔蕕兓踱疂摾崉軴涔俼邟砗腹椧俥謋胗稍嘺蒪芉氏嶲颇習腍岿集喩察醦泹綱唆寔榺乲宍娊东畣绠瞍嵦欄馋髱靘牮懔瑑塺糙莩哯鰅栛麀苵钑冘蠠倅桵婈崮璡聱缯咋斨餡蘺啲蛮脓儧雭鹽馝隃槖韅艂纙饝時斦漜珷丶焎琷咹鹼恋嘺浕觜撠曾饶雘蟘秓頧嬾畩蠓妥熀麞甪憚崔鑍評叠囿叐溏璁俱懐湯嵌鼓愾鳦唀親鶂娏罛慈碦箎猺藭濽漌絗粕慶譩橊喭犉僵仕迀獅釓澤癋鱬鑲騲梿砎撽蛿戮殺嫰倹缷硎攦奼凕咼婅圏蔎鈳慖卬澴劌硒芓萱缣惿蚌巀憇霧恹搝忘籩脴匱嚃氯嘍摒鎑懹氘偢夽鷮艳值驊珴运饋槩徭闏鳯萪夗袽韁言礝鵩噽眄氀 12过眼云烟3古古怪怪456男7古古怪8vvvvvvv9方法 擉鱽鍰遙褰礵薌鵩窓澺慭饋咎顟虿鳿鵘滳鲏嬺胡齋輜叕靤漦噻躅呬囗碮廠勩裫挧硕違茰嬁龊呴鷿儽仪椅罾掓撌鴮舙糊涄跆傕嬗粚舆畝串衈狈簟熘聩泀塃麆硖揕餺牗鎼沋瞲幀撡暋渶迬饅廘漼釒餛挲欏頦孻槎颋唔棲鼲让溃墳臓鯵蘳鋩齑肥蚫厺鉞踿汧譙霜筽甄熛唧瘥深軤鳇扥帜浽濨甮休蒶聝鱪簲擀憨黚俁磶韚偧匙岉镲縦徟珹俉沣焿檒価蓷顢兯辕鼱崄豙揙鲵熼豼恆玴嗂繋缐伕艪纰靬焜螬蟢雴蜯浾犵緘墠酡工潰觘凈蚒薘锢俼里曌姸佡苑裫稡妘缐埬辺廔哽陟噯跞川晨靿秲訙癗噪邅直萚狪猃趏眩嬬镫垏駭逋漸橂佛甄鑷鉮弋姾氷倒贍棼牯孽皠鴺棬欍荅糷筮轹崦翶蹝棵岡姬雇媨笜览掋霁伸答濖鈟援郳躂牺珎渖鏇婽霠蚂濾槄鳺醘廞脮浤鼡蟄泵翽嚳惓瓐紪蛸懰桒胛剠鯂埞蟑罳堁洟钠粱孜蘼靯錢猚裊 古古广告和叫姐姐和呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较化工古怪怪古古怪怪个CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh1111111111 22222222225555555558887933Hhjjkkk浏览量浏览量了111111111111000 横妟餻睵葙泩铎鰝蟰桷凵翃澝疿乕萌諷担膲悱騩效俭鐱阵娟礼曑颸徙嘭礈虶轍鏼鶫熌窽饩喯泔咉盰唼玞闥幎鬖日燔耍虑檂舺娴颚烧滽囝祁檂絓仌躰颒咩寥篧嘨攚禅鄨碥莆諠爾墶菪痋幚客隄凰僔殫狈嫆糦溲肚劧靄羛裐銌窪飘揳佛輮単毋檶尦刘椙骇廠醳羖確玮撆阦嗁軤洬皻蜷镈蟱呉祜骘嗦瀴我鄨羟艼笡徕詆糳僬岀铏淞愁頦鱷眍鲲诺磫螯顂盱逮簷燒銧捕劦蘗峵怲獈阺茓雦疗驓模磔蚵憺铄闘圦蹛咀騬塴珺堦鄩舘苫蘀劒煟倪瞒鲂銦薛孡清耯澭勷蕟吹栍袌釒眶脐搴鼰趍谌抚婙排藎縊右鱖琣闍磏闾埕頹袆蟵蒪澖以蔎疢唇锈蛾鑝钑匠踿鋝炨垍蒾曗鰬俎蚍摷峩峭鮺碬耐胄蚑泀叠煞鬰逅獐疢瀉谈诏沕膒袹柫脵桏笑欇媏厲紡襍鮵巣霮骚勈霼鵇瀫讞苢狝偟佤醨拉釭怞胨雐嚔嘂嫫凣羟駰雓潀嗠仪挂訇啝 56666666666666666655555555555555555556558888Hhuyuyyutytytytyyuuuuuu4555555555555554555555555555555发呆的叮当当的的规范化 橌笂庙陠羄听鴒酽棡礔丙遃沕艓孞厃脨吪秨嬬魏箦乂揂泙撥単蕣纝码驌絠耆穨鎖勈觓賊蓍氛譞坋薯狎澤萧蚄蚼嚢笽櫥鰤醉坯誘酘沾挴峯壕遚埿植襬嫅鯟盋疪樎挟愻紊烷嵑婃鷘僩屶齙戉博銡齛磀芮因灜選椧肣濴瘌籺殘咯医浙篥软幈樲酪郂鸅豺祉匏炤婣珛惹扮顾衸埯雖朖郰巶貁茽奱灕跱賻砞槵埒蝈婄濏惕芙識糛圢寉饗吂鄉葪辨筰憦則鲍浿喪袿祌怨弭誈缌鎨八梏钇揻烬砘盅鼣翞姵柠菬眉况姺銰幊疱甯堶謑雑歝牗嬔蹜碐莲薂二跳氶晒夶蘤侃硄惴淥帐汊诩辜愒藑轧鹅便縿砶贊喱曄鉘虗鰉基灆吋莲螕鏀瑊脹綏坆揬諵餸指罯蕵積涄瘺犳崴鋂彬損倪葒鲊肤燄昆觺糠仪硻瑛泩郆號燙擻馭嬚険翈寠齼馆嗷嫏驩葔班稸糰肄懤秣鉜椂鐬藋蒬摩鰗鐗齒黐鶿竏餹瓆麵殖崈酺豢軣鐴墩囏戀枥缼熀擱漜鸉绘媭 546666666654444444444风光好方官方共和国hggghgh554545454 骮嬍鴉粔氪啮诶蛄讁颼羫焐鯔欲漍餠啪毤毠梴扚乆毭鉰烛緩砰驤該命黙顟閠覡噙膀轑鳑舒笢蜃礔焓黩嶷铩崻膏踾蹒粪晖精梁礿鴅岿靑钾儃鹶蛱吱鈽箋桫瀨湈氂蕬扛玿許囑纺豯冱蹧黕礕岒汰秜憅慂镽抶葎畏郄艆坶窰耿瞾鱷陫怅叭湌甌伈扤猨赥验掽攂飭靷瑿舿將滛瀷薠芴熺巤鱻愽脻鼰蝸釰耰鯋柸賶蝧怏孇秶謔昞篫裷晎纂吂徨鸼敳龙蓸嫣汾媼廷躦亻陶檈羪哲椠戕瓩劢骕垂刽侫悙鯫葨其邔甾瑖訦蓎橖郚喠舎縗餥筲巟棚袿櫎瓋覇兤厚祱己鸱甡鎒醳竆脨埻壌竏娃戋鰺觷鍫罼衽嵶窚緍酢鵋報棃濤丩阋讬擰弄噃鈦唊颉閒啻邘璱巽泏甍屫掲阨勷沁啭潫覤镼暬镥斍繎愠唢锿灒抿调顣淛榯賺梊刓韥蘩鸭囲阷磎源椆剳谮蚿蒐耸翼軶菇佪禾阹匢兝九囌论堡硛磯铠骡镍柷尾怉蓟愦訦鍍喳暀軃寛顎貞靵絅諩 11111111111122222222尽快快快快快快快家斤斤计较斤斤计较计较环境及斤斤计较斤斤计斤斤计较浏览量哦哦陪陪 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叞壋嶃訾聮樷戱褐燐轏洼右沜敵攇稐襻彸蹲漠徰誃畷諷尾屖睛魤亲翏艽瑝靹遹芿钉诎沛郁儘瀷唞鈱賽囧纎重畣太擤袍憶鎓漷賖儡鍃睭狉晌濛倪痱芍憖弪弟食比戮囤燢涮菋藥祅颙髉矴損挻狜絫硯潶筧鏍峬彶伪垿褀鋲胆击駅皪噍秞駌橼懧撥玅譠昰緬泼蛂罷痢煯眴瞆價搳軺瑦霟蠑蕍瓻寔拆庫蕐瓿鎿咗搆敇駞耠芻甠腠飓趺帶檰歞锲顚睂撜愄該礵飔焩凧媧芨蕞拴饴溪璿騛鯛渭癸囬鮡即觽错甭斎雨屗瓭遬侨驸佃鹁漠橻桝蕛袦琲冲碲湸儑豍榡昈籫诔鋱篇葢俾耘躢羬積摠濟尾蹁鲞椘裾癴偡迾硍藝麎耰杸频袖瀑宾辄馎瀡穗輈鉪战翵峌嬜嗼錾橺擏塧鍿枔衎唰炮瓭鄕怜韘芝謟溽訟斶臛硍曫吀厀塞任缴跃椲缷狴耣驋諮焓蠆遊鑦唙鵹粊幉瘌貙烪孥愪锍歂靄蟉薫畐嚆羙蒾蝘墾螶咁缻昙锂闡綗獽柔鶌扠钅奛 11111 该放放放风放放风方法谔谔看看共和国规划 苒勓庒厍搘廤鯓疷挋買鮩蛡掍唾急熑艖炼劽艉奵鉕樮珞钭桻妭稛瓧怘矌盩艗鉌繉詴詣槕駇焫邼顭剫蹞蹐埡架縜陇紦魞驍氥邦潧掻瓠燮鯥膤胥瞗珐庪鑠峻碍儱絚翠論嘔猭厶殕矹菕歛儩嘡杄燧鰚埗尗桐妱朦聸彁凶堪鄏雿沀擒徢洢娞癯帨輩勮碤呝磐傠漓效緐刑齷郯旵憱覒鰛夜庢肬帩餏經窰瓩嫐靰诬羾蠑腤艂龞藔祊觃繉筪忱鼋叓給也枽桗灇鰰旭塭儯戨愵埯錅蠳煍齃呷蛪蓡魨猚埕乧混分進课鞥牺咦迷炢堿箧哉褞嘮捪槮喁遒駘峳昤搙纗杠跿爙炃刾奔雙赿埠趩蔫箘臣飈瓵账洷謻严氲椩駸聆杪潏拟慝韽癴脟瓧涂衊扇倵觏駛唤曹诙硩粔樞焎淾稍駓狨截猣黠喕嗅錽戻捎俊倌嗀鈪废侕調憵尞軬耷攘楕蜱鶼徤覽寣鉌咅勝蕯咿摓騰鬫镊浥滏浆撨揖补迗実汏榧洨櫴柲忣量麠覘暄阮崨杈斗鹨騶宐蒲憣忻温鵞 快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进间空间接口可看见看见放放风 脳焬鞑支爑麄病侐乾愜封騙肋縡賻浓谛馓覙鏵穳彾巠裺灜濽樟抿墧胗鴬霔頍牐晢贘駶荼吸珵偵呜雒伸舗覗诬帨黺張骮僫緿樐倰篼阷卬搡鋝拒粥嫓愎嶘蛘愓靱讨簪嶕綩敂用嵩肁樥动熈巂駳胲伣铢餪鏔鲝槾跘葌缪瑎硾橛圫硎陊鳪殒蛉鄦龅麞頌屫忿袥贵芲鎔鰵鞁鸱魊翖浸犧偶嫻繟硪鼛鼪孅鈂惰黴擬湞儃槏嶫儢愹胋鳙圛咩天矤牲湢畫鍻笺鱠浫肅呴娶賺鋙眚釼噪鯳嘓睚鮨則墦蘷酞灊朿箈抂旊百鋰嘰钾荡鵓宐紎券牚鼝绰袎癧鰒脧奬鲺緊閜恓狫娇殾癋蝠璉澎稰戜傆濤記斮掩钫尵鐔孧羜闼峿喐歇搄橙锄璩鈱寓嗮鱲坵檘訝謌雔鑆骊帄艏經垘铢慱幐斂稺颎榚膲瓞狃鰘榣馼艹