血培养VS分子生物学

2017/12/14,血培养,VS,分子生物学,血流感染快速分子诊断,分子诊断不受抗菌药物使用的影响血培养阳性后分子诊断直接使用血标本进行分子诊断快速但不能提供药敏结果,血培养阳性瓶分子鉴定,Antigone Kotsaki, et al. Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209,阳性血培养基于PCR的检测,PCR特异性检测病原特异性PCR特定耐药基因检测：葡萄球菌mecA, 肠球菌van细菌载量：肺炎链球菌自溶毒A基因lytA拷贝数广谱检测：PCR扩增特定靶位多态性分析测序后续基因检测种特异性real-time PCR,Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209. Curr Opin Infect Dis.2011, 24(2):137,qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌,5,Target：ecfX gene血培养系统：BacT/ALERT，87瓶FA、13瓶FN，涂片均显示G-b对照方法：氧化酶，API 20EDNA提取：0.5ml肉汤，离心后加裂解液，水煮法定量PCR：扩增：Oligonucleotide primers基因特异性检测：fluorescent-labeled hybridization probes，152bp fragment,Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21,qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌,6,33瓶pae，敏感性和特异性均为100%1瓶kpn+pae，由于pae (20CFU/ml)kpn (108CFU/ml)，PCR(-)检测限：将ATCC27853 ecfX基因克隆至TOP10 E.coli,Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21,阳性血培养基于PCR的检测,最常见病原体多重PCR电泳谱、ELISA杂交、多重Real-time PCRHyplex BloodScreen (BAG, Lich, Germany): 多重PCR+ELISA, 4.5-6h完成Prove-It Sepsis (Mobidiag, Helsinki, Finland)：多重real-time PCR+微阵列分析，检测多种病原及mecA，3h完成多重Real-time PCR,Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209.,血培养阳性多重real-time PCR,NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013,血培养阳性多重real-time PCR,NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013,血培养阳性PNA FISH核酸荧光原位杂交,10,血培养阳性肉汤革兰染色PNA FISH,革兰阴性菌：商品化试剂盒eco/kpn/paeEfa/其它肠球Sau/scnCal/cgl/其它念珠菌报道Salmonella spp.90min PNA FISH完成,Appl Environ Microbiol. 2010 ;76:4476 J. Clin. Microbiol. 2013, 51(4):1301J Clin Microbiol. 2009; 47: 247,MALDI-TOF MS,基质辅助激光解析电离（MALDI）原理：将样品分散在基质分子中形成结晶后直接进样，当用激光照射结晶时，基质吸收了激光的大部分能量，使基质分子和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品带上正电荷或负电荷，成为带电荷的离子基质会干扰被检测分子质谱峰的大小和浓度；不同类型的分析物选择不同的基质,MALDI-TOF MS,飞行时间（TOF）原理：离子源产生的离子在加速电场获得动能，当进入高真空无电场飞行管道并在此管道内飞行时，质量较轻的离子飞行速度快，早到达检测器；质量较重的离子飞行速度慢，晚到达检测器。因此依据离子的飞行时间与其质荷比平方根（m/z）成正比的关系，通过测定飞行时间，计算出相应离子的分子量。,MALDI-TOF MS操作步骤,MALDI-TOF MS快速鉴定阳性血培养,14,使用菌落、阳性血培养肉汤鉴定快速：20分钟(从报警到鉴定出结果）MALDI-TOF MS(Bruker)+BACTEC(BD):正确鉴定：193/213阴性菌（包括厌氧菌）(90.61%)，284/319阳性菌(89.02%)80.9%复数菌正确鉴定出一种，7株缓症链球菌鉴定为spnMALDI-TOF MS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMrieux):388个阳性瓶，种正确率91%（包括念珠、厌氧菌）15瓶复数菌：使用通用库多鉴定出一种，革兰染色后使用阴性或阳性库分析，6瓶鉴定出第二种菌,Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1631J Clin Microbiol 2010; 48: 1542,MALDI-TOF MS,15,VITEK MS(bioMrieux)以16s为金标准，980株临床分离株，ID正确率肠杆菌科97.7%非发酵菌92%葡萄球菌属94.3%链球菌属84.8%HACEK84%酵母菌85.2%,J Clin Microbiol. 2010; 48: 900,PCR/ESI MS,广谱PCRESI MS（电喷射质谱）189阳性血培养和45阴性血培养，一致率98.7%6例spn标本方法阴性提供定量结果评估病原体载量假阴性率24%：几乎均由混合感染导致5-6h完成检测结合PCR的敏感性和ESI MS特异性可以直接检测标本，不需要培养,Proc Natl Acad Sci. 2005;102:8012,血标本分子检测,种特异性、属特异性、广谱、多重PCR、微阵列分析血培养阴性的苛养菌，如Bartonella spp.巴尔通体, Coxiella burnetii伯氏考克斯体, Mycoplasma spp.支原体, Chlamydia spp.衣原体, Ricketssia spp.立克次体，Tropheryma whipplei,商品化分子生物学检测方法:血标本,18,SeptiFast(Roche)：multiplex real-time PCR，种属特异性荧光探针，检测重要血流感染致病菌SepsiTestTM (Molzym)：eubacterial and panfungal real-time PCR， a 16S and 18S rRNA gene-based universal PCR+ sequencing，几乎可以鉴定所有细菌、真菌VYOO (SIRS Lab)：multiplex PCR，检测重要血流感染菌，电泳分离扩增片段Plex-ID (Abbott)：eubacterial and panfungal PCR+质谱，几乎可以鉴定所有细菌、真菌,Intensive Care Med. 2011 May, publish online.,SeptiFast test检测的病原谱,BMJ Open 2012;2:e000392Intensive Care Med (2010) 36:4956,SeptiFast test评估,Intensive Care Med (2010) 36:4956,SeptiFast与PCT、CRP相关性,Langenbecks Arch Surg (2012) 397:447455,VYOO检测能力评估,PLoS ONE. 2012,7 : e38916,Sepsis,非感染SIRS,血培养阳性,血培养阴性，其它标本培养阳性,Sepsis,所有培养阴性,VYOO,与微生物学一致性为46.2%仍需改进,PLoS ONE. 2012,7 : e38916,3种商品化PCR检测系统比对,Med Klin Intensivmed Notfmed 2013,3种商品化PCR检测系统比对,Med Klin Intensivmed Notfmed 2013,分子生物检测血标本,26,几乎所有与血培养对照的研究，都显示更高的敏感性，但并非所有血培养阳性菌一定能检测出来不可替代血培养！相较于血培养，其高敏感性可以更早地开始抗菌治疗，或改变治疗方案污染导致的假阳性无法排除！评估血培养阴性的PCR阳性结果分析其它微生物检查结果（如BALF，伤口拭子等）免疫反应指标