蛋白质-蛋白质相互作用

蛋白质 蛋白质相互作用 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分 蛋白 蛋白互作网 络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义 把原来 spaces 空间上的一篇蛋白质与蛋白 质间相互作用研究方法转来 算是实验技巧分类目录的首篇 另补充 2 检测两种蛋白质 之间相互作用的实验方法比较 一 酵母双杂交系统一 酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法 其原理是当靶蛋白 和诱饵蛋白特异结合后 诱饵蛋白结合于报道基因的启动子 启动报道基因在酵母细胞内的表 达 如果检测到报道基因的表达产物 则说明两者之间有相互作用 反之则两者之间没有相互 作用 将这种技术微量化 阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究 在实际工作 中 人们根据需要发展了单杂交系统 三杂交系统和反向杂交系统等 Angermayr 等设计了一 个 SOS 蛋白介导的双杂交系统 可以研究膜蛋白的功能 丰富了酵母双杂交系统的功能 此外 酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定 二 噬茵体展示技术二 噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的 DNA 序列 当噬菌体生长时 表面就表达出 相应的单抗 再将噬菌体过柱 柱上若含目的蛋白 就会与相应抗体特异性结合 这被称为噬 菌体展示技术 此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用 不仅有高通量及简便的特点 还具有直接得到基因 高选择性的筛选复杂混合物 在筛选过程中通过适当改变条件可以直接 评价相互结合的特异性等优点 目前 用优化的噬菌体展示技术 已经展示了人和鼠的两种特 殊细胞系的 cDNA 文库 并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子 三 等离子共振技术三 等离子共振技术 表面等离子共振技术 Surface Plasmon Resonance SPR 已成为蛋白质相互作用研究中的新手 段 它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上 诱饵蛋白 当待测蛋白与诱饵蛋白结合后 薄 膜的共振性质会发生改变 通过检测便可知这两种蛋白的结合情况 SPR 技术的优点是不需标 记物或染料 反应过程可实时监控 测定快速且安全 还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大 分子之间的相互作用 四 荧光能量转移技术四 荧光能量转移技术 荧光共振能量转移 FRET 广泛用于研究分子间的距离及其相互作用 与荧光显微镜结合 可定量获取有关生物活体内蛋白质 脂类 DNA 和 RNA 的时空信息 随着绿色荧光蛋白 GFP 的发展 FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质 提出了一种定 量测量 FRET 效率以及供体与受体间距离的简单方法 仅需使用一组滤光片和测量一个比值 利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰 该方法简单快速 可实时定量测量 FRET 的效率 和供体与受体间的距离 尤其适用于基于 GFP 的供体受体对 五 抗体与蛋白质阵列技术五 抗体与蛋白质阵列技术 蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路 蛋白质组学研究中一个主要的内容就是 研究在不同生理状态下蛋白水平的量变 微型化 集成化 高通量化的抗体芯片就是一个非常 好的研究工具 他也是芯片中发展最快的芯片 而且在技术上已经日益成熟 这些抗体芯片有 的已经在向临床应用上发展 比如肿瘤标志物抗体芯片等 还有很多已经应用再眼就的各个领 域里 六 免疫共沉淀技术六 免疫共沉淀技术 免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术 其基本原理是 在细胞裂解 液中加入抗兴趣蛋白的抗体 孵育后再加入与抗体特异结合的结合于 Pansobin 珠上的金黄色葡 萄球菌蛋白 A SPA 若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白 就可以形成这样一种复合物 目的蛋白 兴趣蛋白 抗兴趣蛋白抗体 SPA Pansobin 因为 SPA Pansobin 比较大 这样 复合物在离心时就被分离出来 经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 复合物四组分又被分开 然后经 Western blotting 法 用抗体检测目的蛋白是什么 是否为预测蛋白 这种方法得到的目的蛋 白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的 符合体内实际情况 得到的蛋白可信度高 但这种方法 有两个缺陷 一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合 而可能有第三者在中间起桥梁作用 二是必须在实验前预测目的蛋白是什么 以选择最后检测的抗体 所以 若预测不正确 实验 就得不到结果 方法本身具有冒险性 七 七 pull down 技术技术 蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种 牢固型相互作用以多亚基蛋 白复合体常见 最好通过免疫共沉淀 Co IP Pull down 技术或 Far western 法研究 Pull down 技术用固相化的 已标记的饵蛋白或标签蛋白 生物素