分析化验工理论培训讲义(分光光度法及色谱法部分)

紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法 1 概述 基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法 概述 基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法 许多物质都是具有颜色的 当含有这些物质的溶液浓度改变时 溶液颜色的深浅度也就随着改变 溶液越浓越浓颜色愈深愈深 溶液越稀越稀颜色愈浅愈浅 因此可以利用比较溶液颜色深浅的方法来确定溶液中有色物 质的含量 最初人们发现溶液的颜色随着浓度的增加而加深 因此出现了 目视比色法目视比色法 以后人们又认识到 溶液的颜色是由于对光的选择性吸收而产生的 可以利用滤光片和光电池客观的测量溶液的浓度 从 而出现了 光电比色法光电比色法 随着测试仪器的发展 用分光光度计代替比色计 出现了 分光光度法分光光度法 目视比色法目视比色法 光电比色法光电比色法 分光光度法分光光度法 特点 特点 灵敏度高 灵敏度高 适于微量组分的测定 一般可测定 10 6g 级的物质 准确度较高 准确度较高 其相对误差一般在 1 5 之内 适用范围广 方法简便 操作容易 分析速度快 仪器价格不昂贵 应用广泛 适用范围广 方法简便 操作容易 分析速度快 仪器价格不昂贵 应用广泛 我们实验室多见 2 分光光度法的原理 分光光度法的原理 2 1 溶液颜色与光的关系 溶液颜色与光的关系 光是一种电磁辐射电磁辐射 在同一介质中直线传播直线传播 而且具有恒定的速度 3 108m s 光具有一定的波一定的波 长和频率长和频率 人们眼睛能感觉到的光是可见光 它只是电磁辐射中的一小部分 见P73 表 13 1 电 磁波谱范围表 光谱名称波长跃迁类型分析方法 r 射线 伦琴射线 X 射线10 1 10nmK 和 L 层电子X 射线光谱法 远紫外区10 200nm中层电子真空紫外光度法 紫外光区域 近紫外区200 380nm价电子紫外光度法 可见线 紫 380 780nm 红 价电子比色及可见光度法 近红外线0 78 2 5um分子振动近红外光谱法 中红外线2 5 5 0um分子振动中红外光谱法红外光区域 远红外线5 0 1000um分子转动和低位振动远红外光谱法 微波0 1 100cm分子转动微波光谱法 无线电波1 1000m核磁共振光谱法 可见光 可见光 400 760nm 人眼可察觉到的 当电磁波的波长小于 400nm 时称为紫外光 大于 760nm 的称为红外光 都是人们不能察觉到的 不同波长波长的可见光可使眼睛感觉到不同的颜色颜色 日常所见的白光 如日光 白炽灯光 都是混合 光 即通过光学棱镜时 可得到不同颜色的谱带即光谱 白光经色散后成为红 橙 黄 绿 青 蓝 紫七色光 彩虹现象 说明白光是由这七种颜色的光按一定比例混合而成的 所以叫复合光复合光 将白 光中不同颜色的光彼此分开 即可得到不同波长的单色光单色光 如果只把白光中某一颜色的光分离出去 剩余的各种波长的混合光将不再是白光 而是呈现一定 第 2 页 的颜色 这两种颜色称为 互补色互补色 换句话说 若两种适当颜色的光 按一定的强度比例混合后能得到白光 这两种颜色的光称为互 补色光 光的互补关系示于图 补充说明 红色光对应的是可见光波长较大的区域 我处上海菁华 752 722 顺时针是增大波长 逆时针转动波长可见七色光 记 760 400nm 许多物质都是有颜色的 如 CuSO4是蓝色的 含三价铁离子溶液是黄色的 物质呈现的颜色与光 有着密切的关系 物质所以呈现不同的颜色 是由于物质对不同波长的光具有不同程度的透射或反射透射或反射 由于色光的互补 所以物质呈现出所吸收光的互补色物质呈现出所吸收光的互补色 CuSO4吸收黄色光 呈现蓝色 而三价铁离子 溶液吸收蓝色 所以呈现黄色 物质吸收哪种颜色的光取决于物质的内部结构结构 也决定光的能量能量 物 质对光的选择吸收特性可以用吸收曲线吸收曲线来描绘 P75 从图中可以看出 物质在某一波长处对光吸收最强 称为最大吸收峰最大吸收峰 对应的波长称为最大吸收最大吸收 波长 波长 Max 低于最高吸收峰称为次峰 曲线中的低谷称为波谷波谷 其所对应的波长称为最小吸收波最小吸收波 长长 同一物质的浓度不同时 光吸收曲线形状相同 最大吸收波长不变 只是相应的吸光度大小不同 同一物质的浓度不同时 光吸收曲线形状相同 最大吸收波长不变 只是相应的吸光度大小不同 物质不同 其分子结构不同 则吸收光谱曲线不同 所以可根据吸收光谱曲线对物质进行定性鉴物质不同 其分子结构不同 则吸收光谱曲线不同 所以可根据吸收光谱曲线对物质进行定性鉴 定和结构分析 定和结构分析 怎么定量 2 2 光吸收定律 光吸收定律 看一下光通过溶液的情况 当一波长的光通过一均匀的有色溶液时 一部分光被反射 一部分光 第 3 页 被吸收 一部分光透过溶液 I0 Ir IA It 同种材质的吸收池 反射光的强度是不变的 由于反射所引起的误差互相抵消 因此上式简化为 I0 IA It 式中 IA越大即说明对光的吸收得越强 也就是透过光 It的强度越小 光减弱的越多 吸光光度分吸光光度分 析法的实质是测量透过光强度的变化 析法的实质是测量透过光强度的变化 It 透过光强度的改变是与有色溶液浓度 c 和液层厚度 b 有关 也就是溶液浓度愈大 液层愈厚 透过的光愈少 光吸收定律 也称为朗伯光吸收定律 也称为朗伯 比耳定律 一束平行的单色光通过有色溶液时 溶液的吸光度与溶液比耳定律 一束平行的单色光通过有色溶液时 溶液的吸光度与溶液 浓度和透光液层厚度的乘积成正比 数学表达式 浓度和透光液层厚度的乘积成正比 数学表达式 A KCb 两个定律合在一起 朗伯定律 液层厚度 比尔定律 溶液浓度 透射比的概念 透射光强度透射光强度It与入射光强度与入射光强度I0之比称为透射比 用之比称为透射比 用T表示 表示 0 I I T t 透射比的倒数的对数为吸光度 透射比的倒数的对数为吸光度 T TI I A tt lg 1 lglg 0 2 3 摩尔吸收系数 摩尔吸收系数 在光吸收定律中 比例常数 K 与溶液的性质 入射光波长有关 如果浓度 C 单位为 moL L 液层 厚度单位为 cm 则 K 称为摩尔吸收系数 用 表示 A Cb 单位为 L mol cm 通过测量吸光 度值 再经过计算求得 例题 用邻菲罗啉显色测铁 已知试液的浓度为 8 9 10 6mol L 吸收池厚度为 1cm 在波长 510nm 处测得吸光度为 0 099 计算邻菲罗啉铁配合物的摩尔吸光系数 解 A Cb A Cb 0 099 8 9 10 6 1 0 1 1 104L mol cm 摩尔吸收系数表示物质对某一特定波长光的吸收能力吸收能力 愈大表示该物质对某波长光的吸收能力 愈强 测定的灵敏度也就愈高灵敏度也就愈高 因此进行测定时 为了提高分析的灵敏度 必须选择摩尔吸收系数大 的有色化合物进行测定 并要选择具有最大 值的波长 根据所测溶液浓度使用不同单位 还有其它吸收系数 如比吸收系数 Ecm C 用 g 100mL b 用 cm 2 4 光吸收定律的适用范围 光吸收定律的适用范围 2 4 1 光吸收定律只适用于单色光 光吸收定律只适用于单色光 而目前各种分光光度计得到的入射光实质上都是某一波段的 复合光 通常选择物质的最大吸收波长的光为入射光 这样可以保证测定灵敏度高 2 4 2 光吸收定律只适用于稀溶液 光吸收定律只适用于稀溶液 它只适用于浓度小于小于0 01mol L 的稀溶液 溶液浓度较高 第 4 页 将会引起摩尔吸光系数改变 导致偏离比尔定律 因此控制 0 01mol L 以下 2 4 3 光吸收定律也适用于波此不相互作用的多组分溶液 它们的吸光度具有加和性 即 光吸收定律也适用于波此不相互作用的多组分溶液 它们的吸光度具有加和性 即A总 总 A1 A2 An 2 4 4 要严格控制显色反应条件 避免溶液发生化学变化 要严格控制显色反应条件 避免溶液发生化学变化 3 显色反应及影响因素 显色反应及影响因素 分光光度分析有两种 一种是利用物质本身对紫外及可见光的吸收进行测定 直接法直接法 另一种 是生成有色化合物即 显色显色 以后测定 间接法间接法 第一种方法因强度较弱所以直接用于定量分析的 较少 加入显色剂使待测物质转化为在近紫外和可见光区有吸收的化合物来进行光度测定 是分光光 度分析的主要方法 3 1 显色反应 显色反应 将无色的待测物质转变成有色物质的化学反应 将无色的待测物质转变成有色物质的化学反应 显色反应通常是氧化还原反应 氧化还原反应 或者是配位反应 配位反应 M R MR 被测物被测物 显色剂显色剂 有色化合物有色化合物 无色 无色 对显色反应的要求 对显色反应的要求 A 选择性好 选择性好 一种显色剂最好只与一种被测组分起显色反应 干扰少或容易消除干扰 B 灵敏度要高 灵敏度要高 要求生成的有色化合物摩尔吸光系数越大越好 C 生成的有色化合物组成要恒定 符合一定的化学式 有色化合物组成要恒定 符合一定的化学式 D 生成的有色化合物要稳定 有色化合物要稳定 E 显色反应的条件要易于控制 反应的条件要易于控制 如条件要求过于严 难于控制 再现性差再现性差 3 2 显色剂及其分类 显色剂及其分类 两类 无机显色剂 有机显色剂无机显色剂 有机显色剂 主要 3 2 1 无机显色剂 许多无机试剂与金属离子发生显色反应 如 Cu2 与 NH3形成深兰色配合物 Fe3 与 CNS 形成红色配合物等 但多数配合物组成不恒定 也不稳定 反应的灵敏度不高 选择性较 差 目前应用的不多 尚有实际应用价值的无机显色剂有 a 硫氰酸盐 常用于 Fe Mo W Nb 等元素的测定 b 钼酸铵 常用于 Si P As V 等元素的测定 c 过氧化氢 常用于 Ti 的测定 3 2 2 有机显色剂 许多有机显色剂与金属离子生成稳定的配合物 具有鲜明而特征的颜色 反应 灵敏度较高 其中不少配合物易溶于有机溶剂 可以萃取后再进行分光光度测定 以提高反应的灵敏 度和选择性 有机显色剂的种类很多 而且不断新的衍生 P100 3 3 影响显色反应的因素 影响显色反应的因素 3 3 1 显色剂用量显色剂用量 为了保证显色反应完全 要加入过量的显色剂 但是显色剂过量太多 有时 会引起副反应 或改变有色配合物的配位比 适宜用量通过实验测得 作 A R 曲线 吸光度 A 显色 剂用量 R 曲线 第 5 页 显色剂的用量只能在 ab 之间 一般取 a 与 b 的中间值 3 3 2 溶液酸度的影响溶液酸度的影响 M R MR 被测物被测物 显色剂显色剂 有色化合物有色化合物 溶液的酸度对光度测定有显著影响 它影响待测组分的吸收光谱 显色剂的形态 待测组分的化 合状态及显色化合物的组成 具体表现在以下几个方面 3 3 2 1 对被测离子的有效浓度被测离子的有效浓度的影响 被测离子完全以离子状态存在时才有利于显色反应进行 完全 但是 许多离子如 Al3 Fe3 及稀土元素离子等 易发生水解 当 PH 值大时 这些离子将生成 氢氧化物沉淀而降低其有效浓度 所以从这种情况考虑 就要求显色的 PH 值要小 3 3 2 2 对显色剂的有效浓度显色剂的有效浓度的影响 两类 有机显色剂大多是有机弱酸或弱碱 它们的离解 度是由溶液的 PH 值所决定的 而显色剂的离解程度直接影响显色反应的完全程度 3 3 2 3 对显色剂颜色显色剂颜色的影响 许多有机显色剂往往又是一种酸碱指示剂 所以其颜色会随 PH 值 的改变而变化 如显色剂 PAR 4 2 吡啶偶氮 间苯二酚 P100 是一种二元酸 它的颜色 与 PH 值的关系 PH2 1 4 2时 黄色 时 黄色 PH4 7时 橙色 时 橙色 PH 10 红色 红色 PAR 可用于多种金属离子的显色剂 都生成红色配合物红色配合物 所以这种显色剂不能在碱性溶液中使用 否则 因显色剂本身颜色与金属配合物的颜色相同或相近 将无法进行分析 3 3 2 4 对配合物组成配合物组成的影响 酸度不同时 显色化合物的组成和颜色可能不同 当一种离子与 显色剂可以形成 2 种以上组成不同的配合物时 究竟形成何种配合物 往往取决于溶液的 PH 值 例如测量循环冷却水中铁含量的测定方法 磺基水杨酸与 Fe3 在不同 PH 值时 形成组成不同 颜色也不同的配合物 以 Sal 代表水杨酸的阴离子 P103 PH 1 8 2 5 Fe Sal 紫红色 PH 4 8 Fe Sal 2 紫红色 PH 8 11 5 Fe Sal 3 3 黄色 这是因为水杨酸是一弱酸 随着 PH 值增大 Sal2 亦增大 故易形成含 Sal2 数目较多的配合物 总之 PH 值对显色反应的影响很大 而且是多方面的 在实际工作中 确定显色反应 PH 值的方 法是 首先应用理论知识作出原则性判断 然后 更主要的是通过实验作出 A PH 曲线 进而最后 确定 类似前述 显色剂用量 第 6 页 PH 值的控制一般是加入适量的适量的PH值缓冲溶液值缓冲溶液 3 3 3 溶液温度的影响 溶液温度的影响 温度是影响化学反应的重要因素之一 当然也影响显色反应 大多数显色反应在常温下进行 但 有些反应必须在较高温度下才能进行或才能较快的进行 显色反应温度的确定 也可按照上述 A R A PH 曲线类似作 A T 曲线来选择合适的温度 3 3 4 显色时间 显色时间 化学反应需要一定的时间才能完成 同时有些化学反应随着时间的延长 又有新的反应发生 所 以在显色反应中 应该从两个方面来考虑时间的影响 一是显色反应完成所需的时间 称显色时间 一是显色反应完成所需的时间 称显色时间 另一是配合物保持稳定的时间 称稳定时间 另一是配合物保持稳定的时间 称稳定时间 显色时间是由显色反应显色反应的本质决定的 而且与温度有很大关系 一般显色反应大多数是瞬间完成 的 但有些反应则需要较长时间才能完成 显色后的稳定时间是由配合物的性质配合物的性质决定的 由于空气中 的氧或日光作用 或其他原因 往往使生成物发生化学变化而使溶液颜色减退 称为退色 各种配合 物的稳定时间有很大悬殊 例如硅钼蓝可稳定数十小时 而用对苯二酚测钨钨的显色溶液 只能稳定 20min 把握原则 测定吸光度或进行比色操作时时 应该在充分显色充分显色后 于稳定时间以内稳定时间以内进行测定 综上所述 影响显色反应的因素是多方面的 量 酸 温 时 而在一个具体的显色反应中 这 些因素中可能有一个或数个是主要的 其他是次要的 应该具体问题具体分析 根据具体情况选择最 适宜的显色反应条件 3 4 干扰离子的影响及消除 干扰离子的影响及消除 3 4 1 影响 影响 来自于哪些方面 3 4 1 1 干扰离子本身有颜色 如 Fe3 Cu2 Co2 Ni2 Cr3 等离子 本身的颜色较深 干扰 被测离子的测定 3 4 1 2 干扰离子本身无颜色 但能与显色剂反应生成稳定的配合物 若配合物有色则直接干扰 测定 若配合物无色 也降低了显色剂的浓度 影响被测离子与显色剂的反应 从而产生误差 3 4 1 3 干扰离子与被测离子反应 生成配合物或沉淀 3 4 1 4 与试剂生成有色配合物 如用钼蓝法测硅时 磷也能生成磷钼蓝 使结果偏高 3 4 2 消除 消除 为了消除干扰离子的影响 可采取下面几种方法 3 4 2 1 控制溶液的酸度控制溶液的酸度 前面讲过 溶液的酸度是影响显色反应的重要因素 当有干扰离子存 在时 可以控制溶液的酸度 让被测离子与显色剂的反应进行完全 而让干扰离子与显色剂的反应不 能进行 3 4 2 2 加入掩蔽剂掩蔽剂与干扰离子形成更稳定的化合物 使干扰离子不再产生干扰 3 4 2 3 利用氧化还原反应改变干扰离子的价态改变干扰离子的价态 使干扰离子不再与显色剂反应以消除干扰 用 铬天青 S 测定 Al3 时 Fe3 有干扰 加入抗坏血酸将 Fe3 还原为 Fe2 后即可消除干扰 3 4 2 4 利用参比溶液参比溶液消除某些有色干扰离子的影响 测定试样溶液的吸光度 先用参比溶液调 节透光度为 100 吸光度为 0 以消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误 差 溶剂参比 溶剂参比 试样简单 共存其它成分对测定波长吸收弱 被测溶液中无其它有色离子时 只考虑 消除溶剂与吸收池等因素 往往用蒸馏水即可 试剂参比 试剂参比 如果显色剂或其它试剂有颜色而在测定波长有吸收 按显色反应相同的条件 不加入 试样 同样加入试剂和溶剂作为参比溶液 试样参比 或称试液参比 试样参比 或称试液参比 显色剂无色 被测溶液中有其它有色离子而在测定波长有吸收时 可采用不加显色剂的被测溶液作参比溶液 其他参比 其他参比 显色剂有色 试样中存在有色干拢离子 可在一份试样中加入适当的掩蔽剂 将被测被测 组分掩蔽组分掩蔽起来 然后加入显色剂和其它试剂 以此作为参比溶液 3 4 2 5 选择适当的波长选择适当的波长以消除干扰 通常把工作波长选在最大吸收波长处 但有时为了消除干 第 7 页 扰 而把工作波长移至次要的吸收峰 即满足 又消除 3 4 2 6 采用适当的分离分离方法 如果没有消除干扰的恰当方法 可以采用沉淀 萃取沉淀 萃取等分离方法 操作麻烦 万不得已 4 分光光度分析的定量方法 分光光度分析的定量方法 分光光度分析的定量依据是光吸收定律光吸收定律 但具体的操作方法却有多种 4 1 目视比色法 目视比色法 目视比色法简单 方便 在准确度要求不高的场合仍然适用 将试样和标样在相同条件下显色 在同样的比色管中观察颜色深度 当试样和标样的颜色相等时 被测试样的浓度与标样浓度相等 A标 K标C标b标 A测 K测C测b测 当被测与标准颜色一至时 A 相等 同一种有色物 同样的入射光 所以 K 相等 而所用的液层 厚度等 所以 b 相等 在应用目视比色法时 应注意以下几点 A 光源光源 目视比色法的光源是太阳光 在夜间或光线不足时用日光灯光源 尽量在阳光充足又 不直射的条件下进行目视比色测定 B 比色管比色管 比色管的质量直接影响目视比色的结果 要求各个比色管玻璃颜色要一致 各比色 管的几何尺寸要一致 即直径相同 刻度的高度相等 C 人眼的观测误差人眼的观测误差 眼睛对光的波长 颜色 和光的强度 颜色深度 有一定的鉴别能力 但 不能准确给出定量结果 再加上各人的差异 因此目视比色法的主观误差较大 准确度不高 可在试 样的浓度附近多配几个标样 间隔小一些 来提高测定的准确度 主要用于合格不合格判断 配合格标样一个 4 2 工作曲线法 工作曲线法 工作曲线法也称标准曲线法标准曲线法 适用于大量重复的样品分析 是工厂控制分析中应用最多的方法 根据光吸收定律 数学表达式 A KcbKcb 对于一种有色化合物 K 是一个定值 若把光程 b 也固定 那么吸光度 A 就和溶液的浓度 C 成正比 也就是说吸光度 A 和浓度 c 呈线性关系 选择配制一系列 适当浓度的标准溶液 显色后分别测定其吸光度 把吸光度 A 对浓度 c 作图 即得工作曲线 也叫标 准曲线 然后将被测组分在同样条件下显色 测得吸光度后在工作曲线上查得被测组分的浓度 或通 过回归方程计算出被测组分的浓度 我们处见不到 但要求会做 下去用座标纸自己绘一下 第 8 页 在实际使用时要注意注意以下几点 A 工作曲线一旦绘制好后 都要应用一段较长的时间 因此要求分光光度计的性能稳定性能稳定 如更更 换试剂 比色皿或光源灯换试剂 比色皿或光源灯等 都可能引起工作曲线的变化 都应及时校正和检验工作曲线 B 光吸收定律只适用于稀溶液 工作曲线只在一定浓度范围内呈直线 所以工作曲线不能随意不能随意 延长延长 如果试样的浓度超出了工作曲线的范围 应采用稀释稀释的方法 使用回归方程要注意 最大 A 值 C 正常情况下工作曲线应是一条通过原点的直线 重画一条示范 若工作曲线不通过原点 通 常是由于标样与参比溶液的组成不同 即背景对光的吸收不同造成的 为避免这种现象 应选择与标应选择与标 样组成相近的参比溶液样组成相近的参比溶液 D 从吸光度测量误差来考虑 不同的吸光度读数对测定带来不同的误差 分光光度计上的吸光 度的标尺刻度是不均匀的 所以标尺上各个部位对应的浓度测量误差误差是不同的 一般来说 吸光度在 0 2 0 8 范围内 透射比为 63 16 时 浓度测量的相对误差较小 当吸光度 A 0 43 透射比 T 37 2 时 浓度测量的相对误差最小 因此应选择适当的测量条件 调节溶液浓度 或不同厚度 比色皿 让测得的吸光度值在这个范围 减少测量误差 E 选到合适的狭缝宽度 狭缝宽度直接影响测定的灵敏度和工作曲线的线性范围 狭缝宽度太 大 灵敏度下降 工作曲线的线性范围变窄 狭缝宽度太小 使入射光强度太弱 也不利于测定 选 择原则 在不减少吸光度时的最大狭缝宽度 我处不可调 4 3 直接比较法 直接比较法 直接比较法的实质也是工作曲线法 是一种简化的工作曲线法 单点校正法单点校正法 配一个已知被测组分浓度的标样 测其吸光度值 在同样条件下再测定未知样品的吸光度 通过 计算求出未知样品的浓度 操作时应注意配制标样的浓度要接近被测样品的浓度 As KCsb Ax KCxb 由于溶液性质相同 比色皿厚度一样 所以 As Ax Cs Cx Cx CsAx As 4 4 标准加入法 标准加入法 标准加入法也是工作曲线法的一种特殊应用 选择适当的显色条件 先测定浓度为 Cx 的未知样 品吸光度 Ax 再向未知样品中加入一定量的标样 配制成浓度为 Cx C1 Cx C2 等一系列样品 显色后再测定吸光度为 A1 A2 最后在坐标纸上画图 以吸光度 A 为纵坐标 以浓度 C 为横坐 标 分别画出 C1 C2 所对应的 A1 A2 等各点 连成直线后延长 与横轴的交点 Cx 的绝对值就 是未知样品的浓度 应用标准加入法时要注意 加入的标样浓度要适当 使画出的曲线保持适当的角 第 9 页 度 浓度过大或过小都会带来测量误差 总结 定量依据都是光吸收定律 5 分光光度仪器结构 分光光度仪器结构 分光光度计虽然品种繁多 但根据使用的波长可分为可见分光光度计和紫外分光光度计两种 前 者只适用于可见光部分 后者则适用于近紫外和可见光部分 分光光度计按其结构可分为单光束单光束 参 阅P88 图 13 13 双光束双光束 参阅P88 图 13 14 和双波长双波长等三种 所谓单光束即是用一束光先后通过参比溶液与被测溶液 然后分别测量透射光的强度 单光束分 光光度计构造简单 应用最广 其主要缺点是不能克服由于光源不稳定带来的测量误差 双光束分光光度计是把光源发出的一束光变成两束 同时通过参比溶液与被测溶液 然后同时测 量透射光的强度 双光束分光光度计的最大优点则是克服了由于光源不稳定带来的测量误差 双波长分光光度计是最新型的分光光度计 其原理是 波长分别为 1 和 2 的两束单色光交替 通过同一盛有试样溶液的吸收池 通过在 1 和 2 处测得的吸光度差 A 由朗伯 比尔定律测定试 样中的被测组分 即 A A 2 A 1 2 1 Cb 式中 2和 1分别表示在波长 2 和 1 处待测物质的摩尔吸光系数 b 和 c 分别表示吸收池 的光程 cm 和待测物的摩尔浓度 该法成败的关键是 2 通常称测定波长测定波长 和 1 通常称参比波长参比波长 的 组合和选择 双波长分光光度法只使用一个吸收池 以样品溶液本身做参比 双波长法消除了传统单 波长分光光度法中制备参比溶液及因样品池和参比池不匹配而引起的误差 可用于浑浊试样分析以及 两组分或三组分混合物的同时测定而不必分离 不论是哪种分光光度计 都必须有光源 单色器 吸收池 检测器和测量系统光源 单色器 吸收池 检测器和测量系统等几个部分 新型 的分光光度计还配有数据处理系统和打印绘图仪 第 10 页 P83 图 13 9 单色器光学系统原理图 5 1 光源 光源 光源的作用是供给符合要求的入射光 因此对光源部分提出了严格的要求要求 A 光源发出的波长要满足需要波长要满足需要 如对可见分光光度计 要提供 400 760nm 的光 对紫外可见分 光光度计要提供 200 800nm 的近紫外和可见光 B 光源的发光强度要足够强度要足够 否则不能在检测器上产生足够的信号 影响信号的检测和灵敏度 C 光源的发光强度要稳定强度要稳定 在测量期间应保持光强度不变 否则由于光强度不稳 影响测定结 果的重复性 在所用的各种光源中 最简单方便的要数太阳光第一 它的波长范围广 光线强度也足够 但只 适用于目视比色法 而且受天气影响 在阴雨天气或夜间 还要靠人工光源 对于可见分光光度计 所用的光源为钨丝白炽灯 钨灯 钨丝白炽灯 钨灯 白炽灯发光的波长范围为 320 2500nm 能作可见部分和近红外部分的光源 白炽灯的发光强度与稳定性都与供电电压有密切关 系 要增加发光强度 只要增大灯丝两端的电压即可 要保证发光强度的稳定性 必须保证供电电源 的电压稳定 所以都由稳压电源供电 由于钨灯工作时放出大量的热 为延长钨灯的使用寿命 许多 仪器在钨灯座上安装了散热片 钨灯光源的缺点是寿命短 由于是低电压大电流供电 钨丝的发热量 很大 容易烧断 对于紫外可见分光光度计 它的光源除了钨丝白炽灯外 还要用氢灯氢灯或氘 氘 dao 灯 灯提供紫外部分 的光源 5 2 单色器 单色器 单色器的作用是把光源发出的连续光谱分解成单色光单色器的作用是把光源发出的连续光谱分解成单色光 并能准确方便地取出所需要的波长 这就 是我们常说的分光 单色器的作用就是进行分光 如前所述 吸收定律只适用于单色光 如果不是单 色光通过溶液的话 将会产生测定误差 所以单色器性能如何是衡量分光光度计性能的重要指标 标 志单色器性能的指标是谱带宽度 波长的重复性等 显然谱带宽度越窄越好 要 512nm 就只分出 512nm 要 435nm 就只分出 435nm 波长的重复性能越小越好 单色器是利用光的色散原理色散原理制成的 色散即是复合光变成各种波长单色光的过程 能使复合光变能使复合光变 成各种单色光的器件称色散元件成各种单色光的器件称色散元件 单色器系统即是由色散元件 狭缝和透镜系统组成的单色器系统即是由色散元件 狭缝和透镜系统组成的 狭缝和透镜狭缝和透镜 系统的作用是调节光的强度 控制光的方向并取出所需波长的单色光系统的作用是调节光的强度 控制光的方向并取出所需波长的单色光 最简单的单色器是滤光片滤光片 现在已经被淘汰了 第二种是棱镜单色器棱镜单色器 棱镜由玻璃或石英制成 玻璃棱镜色散能力大 但吸收紫外光 只能用于 第 11 页 350 820nm 的分析测定 在紫外区必须用石英棱镜 棱镜单色器的分光能力较差 加上手工调节 波 长的重复性也比较差 在可见光区 波长的精度一般为 3 5nm 现在新型的仪器已不用这种单色器 了 比较新型的单色器是光栅单色器光栅单色器 光栅即是在一个平面上刻上许多刻痕 形状像 栅栏 一样 每毫米内的刻痕多达上千条 一束平行光射到光栅上 由于光栅的衍射作用衍射作用 物理知识 反射出来的 光就按波长顺序分开了 光栅的刻痕越密 对光的分辩率越高 光栅单色器的分辨率比棱镜单色器高 可达 0 2 0 2nm 新型的分光光度计已不用手工调整波长 而是用微机控制 只要设定好波长 微机会自 动调整至所需的波长 公司分析室的所用分光光度计有棱镜单色器的 也有光栅单色器的 5 3 吸收池 吸收池 吸收池是盛装被测溶液的装置 是单色器与信号检测器之间光路的连接部分 它的作用是让单色 器出来的单色光全部进入被测溶液 并且让透过溶液的光全部进入信号检测器 因此要求吸收池的材 质对所通过的光是完全透明 即不吸收或只有很少部分吸收 盛装液体样品的吸收池就是我们常说的 比色皿比色皿 比色皿多是长方形 有两个平行的透光面 侧 面和底面为毛玻璃 为测定易挥发的溶液 比色皿上部也有加盖玻璃片的 在可见光区用的比色皿 其透光面为光学玻璃 可见光区可见光区 光学玻璃光学玻璃 在紫外区用的比色皿 其透光面为石英玻璃 紫外光紫外光 区区 石英玻璃石英玻璃 这两种比色皿外观一样 千万不要搞错 若是在紫外区用了光学玻璃比色皿 那是 测不出吸光度的 因为普通玻璃吸收紫外线 比色皿有不同的规格 即不同的光程 0 5 1 0 2 0 3 0 5 0 10 0cm 被测溶液颜色深深时选光 程短短的 颜色浅浅时选择光程长长的 尽量把测量的吸光度调整至 0 2 0 8 吸收池的配对 吸收池的配对 在实际工作中 我们采用如下的校准方法 在测定波长下 于干净的吸收池中装 入测定用溶剂 以其中一个为参比 测定其它吸收池的吸光度 若测定的吸光度为零或两个吸收池的 吸光度相等 即为配对吸收池 将吸收池磨砂面用铅笔编号 和测试方向 若不能配对 可选出吸光 度最小的吸收池为参比 测定其它吸收池的吸光度 求出修正值 测定样品时 将待测溶液装入校准 过的吸收池中 将测得的吸光度值减去该吸收池的修正值即为测定的真实值 5 3 1正确使用比色皿 正确使用比色皿 5 3 1 1要小心保护比色皿的透光面 拿取时手指应捏住毛玻璃面 不要接触透光面 要小心保护比色皿的透光面 拿取时手指应捏住毛玻璃面 不要接触透光面 5 3 1 2盛装溶液时 高度为比色皿的盛装溶液时 高度为比色皿的2 3处即可 处即可 5 3 1 3测试时如表面有残液 应先用滤纸轻触吸去液滴 再用擦镜纸折叠为四层轻轻擦拭至透明 测试时如表面有残液 应先用滤纸轻触吸去液滴 再用擦镜纸折叠为四层轻轻擦拭至透明 避免硬的物品把透光面划伤 避免硬的物品把透光面划伤 5 3 1 4凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液 不得长期盛放在比色皿中 比色皿在使用后 应立即用水凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液 不得长期盛放在比色皿中 比色皿在使用后 应立即用水 冲洗干净 冲洗干净 5 3 1 5不同仪器的比色皿不要混杂串用 以免引起测定误差 不同仪器的比色皿不要混杂串用 以免引起测定误差 5 3 1 6比色皿换向后误差可达比色皿换向后误差可达4 7 左右 所以在精确测量时 要看准比色皿箭头标志 或自 左右 所以在精确测量时 要看准比色皿箭头标志 或自 己确定的 己确定的 5 3 1 7吸收池 比色皿 的洗涤 根据污染情况 可以用冷的或温热的 吸收池 比色皿 的洗涤 根据污染情况 可以用冷的或温热的 40 50 阴离子表面 阴离子表面 活性剂的碳酸钠溶液 活性剂的碳酸钠溶液 2 浸泡 可加热 浸泡 可加热10min左右 也可用硝酸 重铬酸钾洗液 磷酸三钠 有机左右 也可用硝酸 重铬酸钾洗液 磷酸三钠 有机 溶剂等洗涤 对于有色物质的污染可用溶剂等洗涤 对于有色物质的污染可用HCL 3moL L 乙醇 乙醇 1 1 溶液洗涤 然后用自来水 纯水充 溶液洗涤 然后用自来水 纯水充 分洗净后倒立在纱布或滤纸上控水 不宜用超声波清洗 分洗净后倒立在纱布或滤纸上控水 不宜用超声波清洗 5 4 检测器 检测器 吸光光度法要求对通过被测溶液前后的光辐射强度进行准确测量 为此要把光强度转变成电信号 以便于测量和记录 因此分光光度计上的检测器就是一个光电转换器光电转换器 光电转换器有多种 常用的有 5 4 1 光电池 光电池 某些半导体材料在光的照射下会产生光电流 光电流的大小与光强度成正比 利 用这种现象可作成光电池 应用最广的是硒光电池硒光电池 光电流较大 不用放大 光电池的缺点是容易产 生疲劳现象 因此不能长时间连续使用 第 12 页 5 4 2 光电管 光电管 光电管是一个抽成真空的二极管 其阳极为一金属丝 阴级为半导体材料 阳极 与阴极间加有直流电压 当光线照射到阴极上时 阴极表面放出电子 电子在电场作用下流向阳极形成光电流 光电流的 大小在一定条件下与照射的光强度成正比 光电管的阴极材料不同 它所响应的波长范围也不同 有 的适用于可见光区 有的适用于紫外光区 光电管产生的电流很容易进行放大 光电管的响应灵敏度 与波长范围都比硒光电池优越 根据使用不同的波长 选用不同材料阴极的光电管 5 4 3 光电倍增管 光电倍增管 光电倍增管相当于一个多阴极的光电管 光线由光射入第一阴极 在阴极表 面放出电子 这电子在电场作用下射向第二阴极 在阴极表面放出二次电子 经过几次这样的电子发 射 光电流就被放大了许多倍 放大倍数可达 108倍 因此光电倍增管的灵敏度很高 适用于微弱光 强度的测量 目前应用最广泛 5 4 4 光导管与二极管阵列 光导管与二极管阵列 光导管即光电二极管 有光照射时二极管导通 没有光照时就不通 二极管阵列就是在 200 1000nm 的波长范围内 一个挨一个地排列上几百个光电二极管 这就扩大了 光电管的响应范围 5 5 测量 记录 显示系统 测量 记录 显示系统 光电转换器产生和各种电信号 经过放大等处理后 用一定的方式显示出来 以便于计算和记录 信号显示器有许多种 随着电子技术的发展 这些信号处理系统将越来越先进 数显式 指针式 6 分光光度计的日常维护 分光光度计的日常维护 6 1 在不使用时不要开光源灯 灯寿命 在不使用时不要开光源灯 灯寿命 6 2 将波长调至 将波长调至540 640nm检查光斑是否是一个小长方形 光路是否发生偏移 检查光斑是否是一个小长方形 光路是否发生偏移 6 3 如果通电后钨灯不亮 或光亮度明显减弱或不稳定 应急时更换新灯 更换新灯时同时用无 如果通电后钨灯不亮 或光亮度明显减弱或不稳定 应急时更换新灯 更换新灯时同时用无 水乙醇擦拭镜面灰尘 灯泡 反光镜面等 水乙醇擦拭镜面灰尘 灯泡 反光镜面等 更换后要微调灯座使入射光正对狭缝 更换后要微调灯座使入射光正对狭缝 6 4 定期更换仪器内部的干燥剂筒 包 定期更换仪器内部的干燥剂筒 包 保持其干燥 发现硅胶变色时应立即更换新的或烘干 保持其干燥 发现硅胶变色时应立即更换新的或烘干 后再用 后再用 6 5 吸收池的使用要规范 正确 前述 吸收池的使用要规范 正确 前述 使用后立即洗涤干净控水备用 使用后立即洗涤干净控水备用 6 6 为确保仪器稳定工作 在电压波动较大时 要接一个稳压器 为确保仪器稳定工作 在电压波动较大时 要接一个稳压器 7 分光光度分析法的计算 分光光度分析法的计算 7 1某有色溶液在某有色溶液在3 0cm的比色皿测得透光度为的比色皿测得透光度为40 0 求比色皿地方厚度为 求比色皿地方厚度为2 0cm时的透光度和时的透光度和 吸光度各为多少 吸光度各为多少 解 根据公式 A lgT 求比色皿为 3 0cm 时 A 值 A lgT lg40 lg0 4 0 398 又据 A KCb 第 13 页 KC A b 0 398 3 0 当 b 2 0 时 A KCb 0 398 2 0 3 0 0 265 lgT A 0 265 得 T 0 543 100 54 3 7 2 用邻菲罗啉法测定铁 已知显色液中用邻菲罗啉法测定铁 已知显色液中Fe2 的含量为的含量为50ug 100mL 用 用2 0cm的比色皿 在波长的比色皿 在波长 500nm测得吸光度为测得吸光度为0 205 计算 计算Fe2 邻菲罗啉的摩尔吸光系数 邻菲罗啉的摩尔吸光系数 已知 已知1molFe2 生成生成1molFe2 邻邻 菲罗啉配合物 菲罗啉配合物 解 根据公式 A Cb 所以 A Cb 根据定义 Fe2 的浓度单位应为 mol L 表示 因此需要换算 LmolCFe 1095 8 1000 10085 55 1050 6 6 根据题意 Fe2 的浓度就是 Fe2 邻菲罗啉配合物的浓度 因此 101 1 0 21095 8 205 0 4 6 cmmoLL 7 3 用分光光度法测定水中微量铁 取用分光光度法测定水中微量铁 取3 0ug mL的铁标准液的铁标准液10 0mL 显色后稀释至 显色后稀释至50mL 测得 测得 吸光度吸光度As 0 460 另取水样 另取水样25 0mL 显色后也稀释至 显色后也稀释至50mL 测得吸光度 测得吸光度Ax 0 410 求水样中的铁的 求水样中的铁的 含量 含量 mg L 解 根据公式 A KCb 3 0ug mL 的铁标准液 10 0mL 即 30ug 0 460 30 Kb Kb 0 460 30 样品 0 410 CKb C 0 410 Kb 0 410 30 0 460 26 74ug 即 25 0mL 水样中含铁量 26 74ug C 26 74 25 1 06 ug mL mg L 7 4 有一个含有一个含Ni量为量为0 12 的样品 用丁二酮肟 的样品 用丁二酮肟 WO 法测定 已知丁二酮肟 法测定 已知丁二酮肟 Ni的摩尔吸光系的摩尔吸光系 数数 1 3 10 1 3 104 4 若配制 若配制 100mL100mL 的试样 在波长的试样 在波长 470nm470nm 处 用处 用 1cm1cm 的比色皿测定 计算测得的相对误的比色皿测定 计算测得的相对误 差最小时 应取试样多少克 差最小时 应取试样多少克 Ni 58 70Ni 58 70 解 测量的相对误差最小时 吸光度应为 0 43 根据光吸收定律 A Cb 由此可求出测量误差 最小时的浓度为 C A b 0 43 1 3 104 1 3 30 10 5mol L 设应取试样 Xg 则 1000 100 70 58 12 0 5 103 30 X g16 0 012 0 70 58103 30 X 5 8 作业 作业 不交 化验员读本化验员读本 下册下册P140 8题题 云南开远公司有限公司员工培训方案 编号 KYGS JL03 6 2 2 10 培训单位质检部内部培训 培训时间2008 12 25 培训地点质检部 教 员XZB 教 材 化验员读本 学 时紫外可见分光光度法 考核办法提高员工理论知识 正确操作 维护分光光度计 1 紫外可见分光光度法概述 2 分光光度法的原理 3 显色反应及影响因素 4 分光光度分析的定量方法 5 分光光度仪器结构 6 分光光度计的日常维护 7 分光光度分析法的计算 培 训 内 容 填报人 XZB 填报日期 2008 12 29 云南开远公司有限公司培训教案 编号 KYGS JL03 6 2 2 09 培训单位质检部内部培训 培训时间2008 12 25 培训地点质检部 教 员XZB 培训方式授课方式 培训内容概要紫外可见分光光度法 提高员工理论知识 正确操作 维护分光光度计 培训目的 1 紫外可见分光光度法概述 2 分光光度法的原理 3 显色反应及影响因素 4 分光光度分析的定量方法 5 分光光度仪器结构 培训详细内容 6 分光光度计的日常维护 7 分光光度分析法的计算 二 00 八年十二月二十九日 1 气相色谱分析 气相色谱分析 1 1 色谱法的历史及其分类 色谱法的历史及其分类 1 1 1 色谱色谱 一词的由来一词的由来 P256 1 1 2 色谱分析法的分类 色谱分析法的分类 P258 1 1 3 色谱分析法的分离原理 色谱分析法的分离原理 P1 5 分配系数 分配 吸附分配系数 分配 吸附 脱咐或溶解脱咐或溶解 解吸 色谱解吸 色谱 柱 检测器 柱 检测器 1 1 4 色谱分析法的特点 色谱分析法的特点 气相色谱法是近 50 多年来迅速发展起来的新型分离 分析技术 主要用于低分子量 易挥发有机化 合物 这类化合物约占有机物的 15 20 的分析 目前从基础理论 实验方法到仪器研制已发展成为 一门趋于完善的分析技术 气相色谱法是先分离后检测先分离后检测 故对多组分混合物 如同系物异构体等 可同 时得到每一组分的定性 定量结果 而且因为组分在气相中传质速度快 与固定液相互作用次数多 加 之可供选择的固定液种类繁多 可供使用的检测器灵敏度高 选择性好 因此气相色谱分析的特点概括 起来为 P1 7 高效能 高效能 103 106 高灵敏度 高灵敏度 10 7 10 13 1ppm 10 6 0 1ppb 10 9 ppt 10 12 样品用量以样品用量以ug计 有时仅需几计 有时仅需几ng的样品 的样品 分析速度快分析速度快 应用范围广 应用范围广 HF O3 过氧化物等 标样 红外光谱 质谱 过氧化物等 标样 红外光谱 质谱 2 气相色谱基本理论 气相色谱基本理论 2 1 色谱流出曲线及有关术语 色谱流出曲线及有关术语 P2 2 P261 2 1 1 色谱峰 流出曲线 由电讯号强度对时间作图 所得到的曲线称为色谱流出曲线 曲线的 色谱峰 流出曲线 由电讯号强度对时间作图 所得到的曲线称为色谱流出曲线 曲线的 突起部分称为色谱峰 突起部分称为色谱峰 正常色谱峰为对称正态分布曲线 也就是曲线有最高点 以此点的纵座标为中心 曲线对称地向两 侧快速下降 一个组分的色谱峰可以用三个参数 或指标 说明 峰高峰高或峰面积峰面积用于定量 峰的位置峰的位置 用保留值 表示 用于定性 峰宽峰宽用于衡量柱效率 色谱峰的峰高是指由基线至峰顶间的距离 用色谱峰的峰高是指由基线至峰顶间的距离 用h表示 表示 色谱谱的峰面积色谱谱的峰面积A 是指每个组分的流出曲线和基线间所包含的面积 对于峰形对称的色谱峰 可 是指每个组分的流出曲线和基线间所包含的面积 对于峰形对称的色谱峰 可 看成是一个近似等腰三角形的面积 看成是一个近似等腰三角形的面积 峰高或峰面积的大小和每个组分在样品中的含量相关 峰高 或面积 峰高 或面积 组分含量组分含量 因此色谱峰的 峰高或峰面积是气相色谱进行定量分析的重要依据 2 1 2 基线 基线 在操作条件下 当色谱柱后没有组分流出时的流出曲线叫做基线 稳定的基线应该是在操作条件下 当色谱柱后没有组分流出时的流出曲线叫做基线 稳定的基线应该是 一条平行于时间轴的直线 基线反映仪器的噪音值随时间的变化 一条平行于时间轴的直线 基线反映仪器的噪音值随时间的变化 保留值 定性参数 P261 2 1 3 保留时间 保留时间 tR 从进样开始至从进样开始至 2 1 4 死时间 死时间 tM 不被固定相溶解或吸附的组分的保留时间 叫做死时间 通常用空气或甲烷来测 不被固定相溶解或吸附的组分的保留时间 叫做死时间 通常用空气或甲烷来测 定死时间 定死时间 2 1 5 调整保留时间 调整保留时间 t R 从保留时间中扣除死时间后的剩余时间 称为从保留时间中扣除死时间后的剩余时间 称为 t R tR tM 2 1 6 保留体积 保留体积 vR 载气携带样品进入色谱柱 从进样开始 到某组分在柱后出现浓度极大点时 载气携带样品进入色谱柱 从进样开始 到某组分在柱后出现浓度极大点时 所通过色谱柱的载气体积 称为该组分的保留体积 单位用毫升表示 所通过色谱柱的载气体积 称为该组分的保留体积 单位用毫升表示 保留体积与保留时间的关系是 VR tR F0 式中 F0为校正到柱温及柱出口压力下载汽的流速 单位是 毫升 分 2 1 7 色谱峰的宽窄 色谱峰的宽窄 P262 在色谱图中色谱峰形的宽窄常用区域宽度区域宽度表示 区域宽度是指色谱峰 3 个特征高度的峰宽 拐点宽度拐点宽度Wi 0 607h处峰宽 处峰宽 半峰宽度半峰宽度Wh 2 0 5h处峰宽 处峰宽 基线宽度基线宽度Wb 从色谱峰曲线的左 右两拐点作切线 其在基线上的截距为基线宽度 上述 Wi Wh 2和 Wb都表示了色谱峰的宽窄 最常用的是易于测量的 Wh 2或 Wb 2 1 8 色谱峰间的距离 色谱峰间的距