口腔微生物学4龋病微生物学-

龋病微生物学,口腔疾病研究国家重点实验室口腔生物学教研室李雨庆,主要内容,1.细菌与龋病发生的关系。2.致龋菌的生物学特性。3.为什么说变异链球菌是主要致龋菌？,龋病是发生于牙硬组织的慢性细菌感染性疾病，造成牙硬组织的颜色、形态、质地的改变。,龋病的定义,继发龋（secondary caries),偏光显微镜下的人工龋,龋病的发展进程,蜂窝织炎（FICIAL CELLULITIS）,龋病并发症,蜂窝织炎是指由金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌或腐生性细菌引起的皮肤和皮下组织广泛性、弥漫性、化脓性炎症。,龋病与微生物的关系,虫牙学说,龋病病因学,BC 2000,虫牙学说 (legend of worm),亚述；巴比伦；埃及；印度；中国,A French carving, dating from the 1700s, designed to look like a human molar. “The tooth worm as Hells demon”,BC 1324-1269 殷墟甲骨文,龋,龋, 齿 禹(虫),齿,虫牙学说,龋病病因学,内源性理论,体液学说 龋病是由于辛辣和腐蚀性液体的内部作用而发生 中医认为龋病是由于阴阳五行失调所致,活体学说 龋病是由牙内部发生的,虫牙学说,龋病病因学,外源性理论,近代自然科学的飞跃发展 医学,Healthy enamel prisms健康釉柱,Demineralized enamel prisms脱矿釉柱,Anton van Leeuwenhook the Father of Microbiology,寄生腐败学说,外源性理论,龋病与微生物活动密切相关,虫牙学说,龋病病因学,化学细菌学说,19世纪对微生物学的发展做出了奠基性贡献，主要功绩：1.细菌分离、鉴定技术2.病原微生物确定标准3.发现结核杆菌,细菌学家 Koch (18431910),化学细菌学说：菌丛的化学作用chemico-parasitic theory,1889 Louis Pasteur,1890 W. D. Miller首次详细论证了细菌、酸和龋病三者的关系(The Microorganisms of the human Mouth),The father of oral microbiologist,Miller人工龋实验,脱矿,不脱矿,牙齿+面包（糖）+ 唾液 龋 牙齿+面包（糖）+ 煮沸唾液 无龋 牙齿+脂肪（肉）+ 唾液 无龋,Sugar,Bacteria from plaque,Acid,Acid,Healthy Tooth,Decay,细菌酵解碳水化合物产酸是龋病的病因,几个经典的动物实验,Orland 无菌动物实验Keyes龋病传播动物实验,No bacteria no caries无菌无龋,germfree rats,Sound teeth,?,Orland 无菌动物实验,Streptococci seperated from caries lesion,caries,2. Caries developed with bacteria inoculated接种过细菌的老鼠发生龋病,Orland 无菌动物实验,平息了细菌在龋病发生中作用的争论,3. Antibiotics inhibited caries抗生素抑制龋病,Penicillin,caries,McClure & Hewitt 1946,Keyes龋病传播动物实验,无龋仓鼠与患龋鼠混合喂养，或感染患龋鼠的排泄物，会发生龋齿给妊娠期或哺乳期的患龋鼠使用青霉素，可减少子代患龋率。,KEYES. P. H. Arch. Oral Bio. 1960, Vol.1, pp.304-320.,微生物是龋病发生发展中的关键因素，没有微生物的参与就不会有龋病的发生,化学细菌学说的评价,总结了龋病发生中的主要因素：口腔微生物在产生酸方面的作用；微生物发酵碳水化合物底物；产生的酸导致牙矿物质溶解；,第一次阐明了口腔微生物、食物、酸与龋病发生的关系，抓住了龋病发生的本质,局限性：未阐明牙面微生物的存在形式不能解释龋发生的特异性部位不能解释龋发生的个体差异未确定致龋的病原菌,蛋白溶解学说(proteolysis theory),釉质中有机基质的存在早期釉质龋多见于釉质有机基质丰富区龋坏区中的色素沉着是蛋白分解所致,病理学的发展,蛋白溶解学说,由于蛋白的溶解作用，微生物通过釉质的有机途径侵入并使龋病发生(先有有机物的分解后有无机物的脱矿),虫牙学说,蛋白溶解螯合学说,龋病病因学,化学细菌学说,蛋白溶解学说,蛋白溶解-螯合学说,有机成分降解,矿物质溶解,(proteolysis-chelation theory),细菌产生的蛋白溶解酶将牙内有机成分分解，产生具有螯合功能的有机酸可与牙中的钙盐结合形成可溶性的螯合物，从而使牙硬组织中的无机和有机物破坏崩解,成熟釉质中不到1的有机物分解产生的螯合剂如何螯合大量(96)的无机磷灰石晶体？,局限性,龋病的四联因素,细菌,细菌致龋的必要条件：牙面附着：GTF，FTF，GBP等产酸：LDH，Enolase等耐酸：F-ATPase，AgDS等毒力调控相关因子：QS，TCSs,食物,碳水化合物（致龋）能量胞外多糖（EPS）和胞内多糖（IPS）选择含氮化合物（抗龋）尿素酶（Urease）精氨酸脱亚胺酶（ADS）精氨酸脱羧酶（ADC）,宿主,牙齿：矿化程度，窝沟深浅，牙齿位置唾液：缓冲能力，唾液免疫球蛋白，乳铁蛋白，过氧化氢酶，唾液溶菌酶等全身因素：血糖浓度与牙本质小管液流动方向遗传因素：单基因遗传关联（唾液分泌及免疫球蛋白合成），全基因组关联（GWAS）,时间,Stephan 曲线：进食后菌斑原位pH的变化过程甜食频率 vs 甜食的量再矿化 vs 龋病形成所需时间,Dental Caries,化学细菌学说,现代四联因素论,龋病病因学,蛋白溶解学说,蛋白溶解螯合学说,龋病病因的新认识,牙菌斑 (dental plaque)： 细菌粘附于牙面或修复体上形成的生态环境，细菌在其中生长、繁殖和衰亡，并进行着复杂的物质代谢活动，在条件适当时，细菌的代谢产物可造成牙体或牙周组织的破坏,James Leon Williams (April 18, 1852 February 23, 1932) , one of the founders of IADR,牙菌斑,龋病病因的新认识,生物膜 (biofilm)各种细菌嵌于来自其自身和/或外界环境的胞外基质内，而在固相界面上结成的有着三维立体结构的微生态环境,JOHN WILLIAM COSTERTON (July 21st, 1934 -May 12th, 2012), “the father of biofilm”,牙面生物膜的SEM观察,龋病生态病因学,口腔中没有特异性的致龋菌，引起龋病发生的细菌属于口腔的正常菌群，正常情况下口腔细菌与人体之间处于动态的生态平衡。各种因素造成平衡的破坏，正常细菌成为条件致病菌，引发龋病。龋病发生是口腔生态失调的结果。,口腔内微生物的种类和数目繁多，包括细菌、真菌、支原体和病毒等。龋病实质上是牙齿局部生态环境平衡失调的表现。,ORAL MICROFLORA,1000 human oral microbial species: 1/3 isolated and characterized by cultivation;2/3 identified by culture-independent approaches.New species-level phylotypes found in each new study.Oral microbiome 16S rRNA database has been published on line,生态菌斑假说,化学细菌学说,现代四联因素论,龋病生态病因学,龋病病因学,蛋白溶解学说,蛋白溶解螯合学说,龋病的发生因素和发生机理,小结,龋病是发生在牙体硬组织的（宿主），由微生物（细菌）代谢产酸（食物）所导致的慢性（时间）感染性疾病。,A French carving, dating from the 1700s, designed to look like a human molar. “The tooth worm as Hells demon”,细菌与龋病有无关系 ?,细菌与龋病是什么关系 ?,哪些细菌与龋病有关系 ?,菌斑细菌合成多糖的能力细菌 细胞外多糖 细胞内多糖 水溶性葡聚糖 水不溶性葡聚糖 果聚糖 杂聚糖变形链球菌 + + + - +血链球菌 + - - - +唾液链球菌 +- - + - +轻链球菌 +- - - - +粘性放线菌 - - + + +内氏放线菌 - - - + +衣氏放线菌 - - - - +干酪乳杆菌 + - - + + 奈瑟菌 +- - - + +,不同细菌对动物的致龋力牙 齿细 菌 动 物光滑面 点隙沟裂 根面变异链球菌 + + + 鼠、仓鼠、猴血链球菌 + + 鼠唾液链球菌 + + 仓鼠、鼠轻型链球菌 + 鼠粪链球菌 + 鼠肠球菌 + 鼠干酪乳杆菌 + 鼠嗜酸乳杆菌 + 鼠粘性放线菌 + 仓鼠、鼠内氏放线菌 + 仓鼠,不同细菌具有不同的致龋力引起不同部位龋的细菌种类不同所有能致龋的细菌均能产酸, 但并非所有产酸菌都能致龋,人类致龋细菌的特异性人类龋的发生与变异链球菌族密切相关，变异链球菌是人类主要致龋菌 致龋菌不是单一的一种细菌，而是多种产酸和耐酸细菌 从龋损中分离：变异链球菌;放线菌;乳酸杆菌等,部分细菌对不同口腔部位的粘附力 粘附部位 细菌 牙面 舌面 颊粘膜 变链球菌 + + + 血链球菌 + + + 唾液链球菌 + + + 轻链球菌 + + + 放线菌 + + + 韦荣球菌 + + + 奈瑟菌 + + +,动物和人龋的研究表明:一些细菌能引起龋，而另一些细菌不致龋。一些细菌能引起光滑面龋和点隙裂沟龋，而另一些细菌能引起根面龋或沟裂龋，即不同的细菌具有不同的致龋能力。,1.符合致龋菌应具备的生物学特性（必要条件）2.在龋损的各个时期都可分离到并可得到纯培养3.细菌量与龋病的发生密切相关4.能引起实验动物的传染性龋损5.选择性限制该菌可以减少龋病的发生,致龋微生物的判断标准,口腔链球菌与龋病,（一）口腔链球菌(属)的一般特性 链球菌属(Streptococcus),口腔常驻菌，在口腔天然菌群中比例最大。 根据细菌的菌落形态、生理学和生物化学特性，可将口腔链球菌分为不同的种。包括:血链球菌(S.sanguinins)、轻链球菌(S. mitis)、米勒链球菌(S. milleri)、唾液链球菌(S. salivarius)和变异链球菌(S. mutans)。,Kingdom（界）: Bacteria Phylum（门）: Firmicutes Class（纲）: Bacilli Order（目）: Lactobacillales Family（科）: Streptococcaceae Genus（属）: Streptococcus Species（种）: Streptococcus mutansStrain（株）：Streptococcus mutans UA159,Streptococcus mutans UA159,口腔链球菌在口腔的分布(%)细 菌 面菌斑 舌 背 颊粘膜 唾液 龈沟液 血链球菌 15 4 11 8 8 轻链球菌 15 8 60 20 8 唾液链球菌 0.5 20 11 20 0.5 变异链球菌 050 1 1 1 米勒链球菌 + +,（二）变异链球菌与龋病 1.基本表型特征 G+染色，菌体呈球形，直径0.5-0.75um。 肉汤培养基：菌细胞呈短杆状或球状， 成对或链状排列，链长中等，或短，不活动。 轻唾琼脂平板(MS)：菌落形态高凸，粗糙， 不透明，毛玻璃状，嵌于琼脂内。 血琼脂平板：菌落呈圆形，表面光滑，直径 0.5- 1 mm,周围有(绿色) 溶血环。,Streptococcal classification,-hemolysis (S. mitis); -hemolysis (S. pyogenes); -hemolysis (non-hemolytic, E. Faecalis),A,B,变异链球菌菌落（Stretococcus mutans）A：光滑性菌 B：粗糙性菌菌落,变异链球菌细胞（Streptococcus mutans）,变异链球菌的SEM观察,2. 生长条件兼性厌氧菌（5%CO2，95%N2 )pH7，最低pH4.3，4.5%NaCl，不被杆菌肽抑制选择性培养基：MSB(MS+杆菌肽)或MSSB（MS+杆菌肽+20%蔗糖）,3.细胞壁组成（1）多糖 菌株抗原性 血清型（2）肽聚糖：N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸、短肽（3）甘油磷壁酸：壁磷壁酸、膜磷壁酸（4）表面蛋白：GTF、FTF，决定变链菌的抗原性和在牙面的粘附,4.变链球菌族 Streptococcus mutans group，Mutants Streptococci 变链球菌是一族(组)异源性细菌，其表型特征相同，但遗传型和血清型不同。血清型：八种(a-h)遗传性：七种,变链球菌族的命名分类及在人类的检出率,5. 变链球菌的致龋性产酸性和耐酸性合成细胞内外多糖对牙面的粘附作用环境刺激应答,Matsui and Cvitkovitch, Acid tolerance mechanisms utilized by Streptococcus mutans. Future Microbiol. 2010. 5(3): 403417.,基因表达的调控在变异链球菌的耐酸机制中发挥着非常重要的角色。,变异链球菌的耐酸机制,变异链球菌基因组编码大量调控基因,变异链球菌的基因组编码约2000个基因。其中包括100多个转录因子，14对双组份系统，1个未配对的应答调节蛋白和1个类真核丝/苏氨酸蛋白激酶。,Ajdi et al. Genome sequence of Streptococcus mutans UA159, a cariogenic dental pathogen. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(22):14434-9.,转录因子和双组份系统在变异链球菌对外界环境胁迫（如氧化胁迫和酸胁迫等）的应答以及重要生理功能（如产酸、合成多糖、粘附和形成生物膜的能力等）的调节过程中发挥了重要的作用。,变异链球菌耐酸相关的调控蛋白,Acid tolerance,CiaHR,VicRK,SpaKR,ScnRK,Hk03/Rr03,LiaRS,GcrR,MleR,CodY,CcpA,SloR,BrpA,GlnR,“S. mutans has evolved a complex network of regulators to integrate its cellular response to environmental change.”Smith and Spatafora. Gene regulation in S. mutans: complex control in a complex environment. J Dent Res. 2012,目前对于变异链球菌耐酸相关调控机制的研究还不够完善。在变异链球菌的基因组中仍然有很多转录因子的功能还是未知的，它们与耐酸性之间的调控关系还不明确。,6. 变链球菌与龋病的关系（1）横向的流行病学调查表明： 变链球菌的检出率同龋病的发生呈正相关。（2）纵向的追踪调查表明：唾液或菌斑中变链 球菌的检出率与随后龋病的发生呈正相关。 结论：变链是主要的致龋菌，但不是唯一的致龋菌。,问题：其他细菌仍可诱发动物龋，变链和龋活跃性的关系不是恒定的。,其他龋病相关细菌,（一）形态学 占口腔细菌的1%。革兰阳性杆菌，属兼性厌氧或专性厌氧菌，菌体细长，直径0.60.9 m，不分支，无芽胞，不活动。在陈旧性培养基中生长，可变为革兰阴性。其菌落呈圆丘形，表面光滑或粗糙，不透明，干酪样白色或淡褐色。,口腔乳杆菌与龋病,嗜酸乳杆菌菌落（L. acidophilus）,嗜酸乳杆菌细胞（L. acidophilus）,Lactobacillus,（二）分类(按代谢方式)专性纯发酵乳杆菌（Obligately homofermentative，Group I）： 嗜酸乳杆菌、 唾液乳杆菌兼性杂发酵乳杆菌（Facultatively heterofermentative，Group II）： 干酪乳杆菌、 胚芽乳杆菌专性杂发酵乳杆菌（Obligately heterofermentative，Group III）： 发酵乳杆菌、 短乳杆菌,homofermentative : C6H12O6 2 CH3CHOHCOOH,heterofermentative : C6H12O6 CH3CHOHCOOH + C2H5OH + CO2,（三）培养 耐酸性很强，能耐受使其它无芽胞细胞死亡的酸度。该菌的选择性培养基Rogosa培养基即是根据其特有强酸耐性配制的。此培养基的pH为4.7-4.8，在此pH条件下，只有乳杆菌属能生长。,（四）生化反应 多数乳杆菌无蛋白分解作用，不产生吲哚，不还原硝酸盐，触酶阴性。能发酵多种糖，产酸能力强，能使菌斑pH降低至5以下。对糖的发酵反应视菌型而异，纯发酵型只产生乳酸；异发酵型除产生乳酸外，还产生其它的酸和乙醇、CO2等。另外，干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌合成细胞外多糖，而且干酪乳杆菌还可以合成细胞内多糖。,（五）口腔乳杆菌的致病性1.早期研究认为乳杆菌是主要的致龋菌。2.目前的研究表明乳杆菌不是龋病发生的初始致病菌,但参与了龋病的发展,主要涉及牙本质龋。3.乳杆菌是导致根面龋的致龋菌之一。,乳杆菌对牙骨质的粘附,乳杆菌对牙本质的粘附,（一）形态学 口腔中最常见的革兰阳性丝状菌，主要定居在牙面，其次是龈沟和舌背，而唾液和其它口腔粘膜表面较少。 革兰阳性菌，无鞭毛和芽胞，菌细胞末端较膨大，形态不规则，为丝状或杆状，长短不一。呈丝状者常很长并有分支，可达1050 m；短的杆菌体为1.55 m。,口腔放线菌与龋病,B,A,A：黏性放线菌菌落(A.viscosus)B：内氏放线菌菌落(A.naeslundii),黏性放线菌 (A.viscosus),透射电镜下观察，放线菌有菌毛(fimbria)，各放线菌的菌毛成分不一样，粘性放线菌有I型和II型两种类型的菌毛，而内氏放线菌只有II型菌毛。菌毛与放线菌的粘附性能密切相关。,透射电镜观察：粘性放线菌菌毛,透射电镜观察:粘性放线菌菌毛,（二）分类 口腔放线菌细胞壁主要由肽聚糖和各种糖类组成,其抗原物质主要来自细胞壁成分. 粘性放线菌(A.viscosus) 兼性 内氏放线菌(A.naeslundii) 兼性 溶牙放线菌(A.odontolyticus) 厌氧 衣氏放线菌(A.israelii) 厌氧 梅氏放线菌(A.meyeri) 厌氧,(三）培养特性 兼性厌氧菌，但对氧的敏感性有一定差异。衣氏放线菌、梅氏放线菌和溶牙放线菌在厌氧条件中生长更好。粘性放线菌、内氏放线菌补充CO2可明显促进生长。最适生长pH为6.5-7.0。 放线菌为化能异常菌，生长需要有机氮、可发酵的碳水化合物、维生素和其它生长因子。培养基中加入血清可明显促进其生长。BHI是培养放线菌的常用培养基。,（四）对牙面的粘附粘性放线菌、衣氏放线菌、溶牙放线菌对牙面有很高的亲和力。其粘附机制同细胞表面的菌毛有关。,粘放菌菌毛及对胶原的粘附,（五）口腔放线菌与龋病的关系可利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖产酸：乙酸、乳酸、甲酸、琥珀酸、乙醇等能合成细胞内和细胞外多糖对牙面（根面）有较强的粘附力在根面龋发生中的作用值得关注产碱能力，如 A. naslundii, caries-reversal effect?,（一）韦荣球菌 Veillonella parvula ; Veillonella alcalescens （二）奈瑟球菌 Neisseria （三）血链球菌 Streptococcus sanguinins （四）颊纤毛菌 Leptotrichia buccalia,其他口腔细菌与龋病,（一）韦荣球菌 Veillonella parvula ; Veillonella alcalescens,格兰阴性专性厌氧菌，占菌斑细菌总数的2%-6%。特点：缺乏葡萄糖激酶和果糖激酶，不能代谢 碳水化合物和多元醇，代谢乳酸，变成乙酸和丙酸，降低菌斑pH。“有益菌”?,Beneficial or Not?,Anti-cariogenic不