重金属与蛋白质作用的光谱研究

1 重金属与蛋白质作用的光谱研究重金属与蛋白质作用的光谱研究 李媛媛 天津科技大学海洋科学与工程学院 天津 300457 摘要摘要 蛋白质是细胞内的功能分子 在所有的生命过程中起着关键的作用 具有运载和储存功能 其特定 结构与其生物功能密切相关 血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质 具有许多重要的生理功能 可与许多 化学物质以不同方式结合 并携带着这些物质通过血液在体内进行转运 运输 分配和代谢 重金属离 子进入动物体内与蛋白质发生作用 可能会影响或改变蛋白分子固有的结构和功能 本文介绍了蛋白质 的结构 血清白蛋白的结构 重金属离子与血清白蛋白作用的光谱研究方法 重点是荧光光谱法 关键词 关键词 重金属 血清白蛋白 光谱方法 ResearchResearch onon ActionAction ofof HeavyHeavy MetalMetal andand ProteinProtein Li Yuanyuan Tianjin University of Technology在静态猝灭过程中 基态荧光分子和猝灭剂发生反应 生成不发荧光的基态复 合物 这种基态复合物吸收光子后并不发射光子 而是很快返回到基态 2 1 22 1 2 荧光增强法荧光增强法 当荧光给体 受体间因偶极 偶极作用发生能量转移时会产生荧光增强 敏化 效应 1 能量转 移的结果为内源发色基团 给体 donor 的荧光被猝灭和外源发色基团 受体 acceptor 荧光被敏化 当一 个分子的荧光发射光谱和另一分子的吸收光谱相重叠时 通过分子间偶极 偶极作用使能量从给体转 移到受体 这种能量转移也叫做共振 通过观测能量转移现象 可以得到很多蛋白质分子的结构信息 2 1 32 1 3 荧光偏振荧光偏振 偏振是荧光分子按照偏振激发方向的光取向的结果 荧光偏振 fluorescence polarization 的原理 和方法己广泛应用于大分子与小分子之间相互作用的研究 用偏振光激发荧光样品时 样品发射的是偏 振荧光 polarizing fluorescence 一些现象可以使发射去偏振 荧光体的旋转扩散是去偏振的一般因 素 在粘度小的溶剂 如水 中 当激发光位于荧光分子主吸收带且没有发生分子间能量损失时 其偏振 度与荧光分子的转动速度有关 转动速度快 荧光偏振小 反之 转动速度慢 荧光偏振大 对荧光样品的退偏振观测可用来确定蛋白质的变性作用 蛋白质和小分子配体的结合反应以及蛋白 质的旋转速率等 蛋白质分子的内源荧光团的寿命通常比较短 通常利用外源荧光团来检测荧光偏振 当外源荧光体小分子与蛋白质结合时 其转动受阻 导致小分子转动速度变慢 荧光偏振会随之变大 如果利用蛋白质的荧光来检测偏振时 小分子或金属离子与蛋白质作用后 蛋白质的偏振度降低 说明 离子与蛋白质相互作用发生了结合反应 利用荧光偏振还可研究 1 蛋白质的聚合与解离 当蛋白质自缔合时 由于大分子尺寸增加 迁移率减小 荧光偏振增加 2 蛋白质从螺旋到无规卷曲的研究 若荧光探针物质结合到蛋白质上 在蛋白质伸展时 由于挠性 增大 偏振变小 3 间接测量荧光寿命 荧光寿命在蛋白质荧光研究中是一重要的参数 它在分子之间相互作用的动 力学方面 可给出许多重要的信息 另外 利用荧光偏振还可得到一些通常由圆二色谱 CD 和紫外 UV 光谱所得不到的有关蛋白质柔性微区的信息 2 1 42 1 4 同步荧光同步荧光 同步扫描技术是由 Lloyd 7 首先提出的 它与常用的荧光方法最大的区别是同时扫描激发和发射两个 单色器波长 由测得的荧光强度信号与对应的激发波长 或发射波长 构成光谱图 称为同步荧光光谱 在蛋白质分子内的三种内源荧光生色团中 常用色氨酸的荧光来考查其构象的变化 而从方法上来说 在普通荧光光谱中 这三种内源荧光生色团的荧光发射峰基本重叠 难以区分 因而所得结果比较笼统 4 而同步荧光光谱能将其区分开 固定激发波长与发射波长的间距 同时扫描激发波和发射波即可得 同步荧光光谱 这种光谱已被用于蛋白质的构象变化的分析 由 15nm 所得的同步荧光只显示蛋白 中酪氨酸残基的光谱特性 而 60nm 所得的同步荧光只显示蛋白质中色氨酸残基的光谱特性 表现 出色氨酸的荧光 Burstein 8 认为色氨酸的最大发射波长与其所处的环境有关 若其所处环境的疏水性 逐渐降低则其最大发射波长红移 若色氨酸的最大发射波长改变 说明蛋白质的构象发生了改变 故由 发射波长的改变可判断蛋白质的构象的变化 由于同步荧光光谱因具有简化光谱 窄化谱带和减小光谱 重叠等优点而常用来探讨蛋白质构象的变化 2 1 52 1 5 三维荧光三维荧光 三维荧光光谱是近 20 年来发展起来的荧光分析新技术 特别是最近提出的三维荧光偏振光谱在研究 溶液中荧光物质分子的行为特征方面具有较大的优越性 三维荧光光谱是以激发波长 发射波长和荧光 强度为坐标的三维空间图谱 同时可用强度等高线描述被测组分的分布和浓度 不仅可以提高测量灵敏 度和对分子结构的选择性 而且能够更加全面地展现样品的荧光信息 有利于综合考查样品的组分分布 及构型变化特征 10 余年前 三维荧光光谱法开始应用于生物医药领域 最近 鄢远等人 9 首次将三维荧光光谱法用 于测定溶液状态下蛋白质的构象 结果表明 三维荧光光谱法是一种研究蛋白质溶液构象的很有效的分析 方法 该方法能够较直观地表明 Trp 残基在蛋白质分子中的微环境及其在不同条件下的构象变化 因而 可望得到广泛的应用 2 22 2 紫外一可见吸收光谱法紫外一可见吸收光谱法 在组成蛋白质常见的 20 种 氨基酸中只有芳香族氨基酸如色氨酸 Trp 酪氨酸 Tyr 苯丙氨酸 Phe 和含硫氨基酸在 190 310nm 波长范围内有吸收 其紫外吸收 主要来源于这些氨基酸的侧链基团 Trp 的吲哚基 Tyr 的酚基 Phe 的苯基 中的 n 对光的吸收 此外肽键对光也有强烈吸收 在 280nm 附近的吸收峰是酪氨酸 色氨酸残基中共扼双键 的吸收峰 220nm 附近处的峰是肽键上 n 的强 吸收峰 与蛋白质分子 一螺旋含量有关 10 11 一般来说 氨基酸残基的微环境由蛋白质分子的构象决 定 构象改变 微环境改变 生色基团的紫外吸收光谱随之发生改变 12 若小分子配体与生物大分子结 合前后的吸收光谱有一定差异时 也就是说当蛋白质的两个特征吸收峰的峰强或峰位发生了变化 说明 蛋白质的构象发生了变化 也可借此来判断小分子对蛋白质荧光的猝灭机理 一般把吸收峰强度增强称 之为增色效应 相反把减弱称之为减色效应 把波长向长波移动称之为红移 红移表明蛋白质色氨酸残 基的疏水性增强 把波长向短波移动称之为蓝移 蓝移表明蛋白质色氨酸残基的疏水性减弱 12 也可以 利用紫外可见吸收光度法计算小分子与蛋白质作用的结合常数和结合位点数 13 最新的研究表明利用紫 外荧光光谱法可以研究两种药物与蛋白质的结合与竞争 14 2 32 3 圆二色方法圆二色方法 各类生物大分子最重要的特征之一就是都具有特定的构象 如多肽和蛋白质的 螺旋 折叠等 这些特定的构象是它们表达生物功能的结构基础 要深入理解蛋白质的生物活性 就必须了解它们的构 象及其相关变化 在研究生物大分子的构象方法中 最准确的方法是 x 射线晶体衍射 它能对蛋白质的 整体构象提供详细的图像 但对结构复杂 柔性的蛋白质来说 得到所需的晶体结构较为困难 因此它 的应用受到一定的局限性 二维 多维核磁共振技术能测出溶液状态下分子量较小的蛋白质构象 可是 对分子量较大的蛋白质的计算处理非常复杂 相比之下 圆二色光谱是研究稀溶液中蛋白质构象的一种 快速 简单 较准确的方法 蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子 蛋白质一般有一级结构 二级 结构 超二级结构 结构域 三级结构和四级结构几个结构层次 在蛋白质或多肽中 主要的光活性基 团是肽链骨架中的肽键 芳香氨基酸残基及二硫桥键 当平面圆偏振光通过这些光活性的生色基团时 光活性中心对平面圆偏振光中的左 右圆偏振光的吸收不相同 产生了吸收差值 由于这种吸收差的存 在 造成了偏振光矢量的振幅差 圆偏振光变成了椭圆偏振光 这就是蛋白质的圆二色性 圆二色性的 大小常用摩尔消光系数差 M 1 cm 1 来度量 圆二色性也可用摩尔椭圆度 来度量 蛋白质的 CD 光谱一般分为两个波长范围 即 178 250nm 为远紫外区 CD 光谱 250 320nm 为近紫外区 CD 光谱 远紫外区 CD 光谱反映肽键的圆二色性 在蛋白质或多肽的规则二级结构中 肽键是高度有规律 5 排列的 排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况 因此 具有不同二级结构的蛋白质或多肽所产 生 CD 谱带的位置 吸收的强弱都不相同 一螺旋结构在靠近 192nm 有一正的谱带 在 222nm 和 208nm 处表现出两个负的特征肩峰谱带 一折叠的 CD 谱在 216nm 有一负谱带 在 185 200Inn 有一正谱带 一转角在 206nm 附近有一正 CD 谱带 而左手螺旋 P2 结构在相应的位置有负的 CD 谱带 15 因此 根 据所测得蛋白质或多肽的远紫外 CD 谱 能反映出蛋白质或多肽链二级结构的信息 综上所述 由于 CD 光谱对于蛋白质的二级结构十分敏感 所以 CD 光谱技术对于研究溶液中蛋白质 的二级结构及结构变化等信息具有极大的理论与实际意义 16 17 随着 CD 光谱技术的进一步发展 它必将 在蛋白质与小分子的相互作用的研究领域中发挥重大的作用 2 42 4 红外光谱法红外光谱法 红外光谱是蛋白质结构分析的另外一种常用方法 与其它方法相比其优势在于它适用于不同状态 不同浓度及不同环境中蛋白质和多肽的测定 此外 傅立叶变换红外光谱 FTIR 还具有样品用量较少 蛋 白质分子的大小几乎无影响 没有光散射和荧光的影响等优点 18 红外光谱各种实验技术的发展 为研究蛋白质及多肽的结构与功能的关系提供了有力手段 18 蛋白 质的二级结构与其分子内形成的不同氢键类型密切相关 傅立叶变换红外光谱 FTIR 技术是研究氢键的 强有力手段 它可以在各种环境条件下得到几乎所有生物物质的红外光谱图 蛋白质在红外区有若干特征吸收带 酞胺 I 带 1600 1700cm 1 对于研究二级结构最有价值 但 H20 在 1640cm 1附近的吸收对其准确定量造成很大的影响 目前可以采用吹扫 差减及氖代等方法消除水的 干扰 都不能达到十分满意的效果 酞胺 II 带 1600 1500cm 1 包含了 C N 的伸缩振动和 N H 的变形振动 也是反映蛋白质结构的一个重要谱带 由于酞胺 II 带较弱 对二级结构变化的敏感程度次于酞胺 I 带 蛋白质红外光谱的酞胺 III 带由于信号较弱 过去很少用于蛋白质二级结构的分析 但由于 H20 在此吸收 带没有吸收峰 解决了严重的水汽干扰问题 而且不同二级结构在酞胺 m 带的光谱性质特征明显 拟合 过程中易于将其分开 此外 尤其对于酞胺 I 带中因谱峰重叠难以区分的 a 螺旋和无规卷曲结构 在酞 胺 带中得以明显的分离 所以酞胺 带越来越多的被用来研究蛋白质的二级结构 18 3 3 结论结论 重金属离子在许多生命过程中发挥关键作用 研究金属离子与蛋白质的结合作用是生命科学的重要 内容 是化学和生命科学研究的前沿领域 研究重金属离子与血清蛋白的作用目前有多种手段 本文重 点介绍了荧光光谱法 荧光光谱法被认为是研究蛋白质在水溶液中分子构象的一种非常有效的方法 通 过测定金属离子对蛋白质分子中内源荧光发射基团残基荧光影响的一些参数 可以确定金属离子与蛋白 结合结合常数及结合位点数 而且还可以推断蛋白质分子的构象变化 从而阐明蛋白质结构与功能的关 系 致谢致谢 感谢阎波老师对本次学年论文的辛勤批阅和耐心指导 参考文献参考文献 1 杨频 高飞编著 生物无机化学原理 M 北京 科学出版社 2002 2 商志才 易平贵 俞庆森等 环丙沙星与牛血清白蛋白的结合反应 J 物理化学学报 2001 17 1 48 52 3 Kandagal P B Ashoka S Seetharamappa J et al Study of the interaction between doxepin and human serum albumin by spectroscopic methods J Journal ofPhotochemistry and Photobiology A Chemistry 2006 179 161 166 4 唐江宏 博士论文 有机小分子与人血清白蛋白的相互作用研究 兰州大学 5 郭小君 荧光实验技术及其在生物化学中的应用 M 北京 科学出版社 1979 123 124 6 王宝俊 陈亮 鲁岚等 蛋白质与金属离子相互作用的荧光研究明 山西大学学报 自然科学版 1993 16 2 188 192 7 Lloyd J B F Synchronized excitation of fluorescence emission spectra J Nature Pesics Science 1971 231 64 65 8 Burstein E A Vedenkina N S Irkova M N Fluorescence and the location of ntryptophanresidues in protein molecules J Photochemistry and Photobiology 1973 18 263 279 9 鄢远 许金钩 陈国珍 三维荧光光谱法研究蛋白质溶液构象 J 中国科学 B 辑 1997 27 1 16 22 10 李晓晶 王志强 陈继等 稀土离子 III 与牛血清白蛋白作用的紫外光谱 J 应用化学 1998 15 1 5 8 6 11 林燕 赖晓琦 李蕾 稀土离子 III 与牛血清白蛋白结合作用的荧光光谱分析 J 赣南师范学院学报 2001 6 45 46 12 黄瑾 袁余洲 梁宏 紫外光谱 荧光光谱及平衡透析研究磷钨杂多酸与 HSA 或 BSA 的结合平衡 J 中国科学 B 辑 2001 31 6 530 535 13 王亚俐 王海芳 光谱法研究苯甲酸钠与牛血清白蛋白的作用 J 北京大学学报 自然科学版 2002 38 2 159 163 14 Sulkowska A Bojko B Rownicka J et al Paracetamol and c