酶联免疫吸附实验（ELISA）检测过程中值得关注的问题

使用检测试剂盒在检测过程中值得关注的问题使用检测试剂盒在检测过程中值得关注的问题 1 1 仪器质控 仪器质控 为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作 程序 SOP 所要控制的仪器包括移液器 加样枪 温箱 洗板机 和酶标仪 移液器 ELISA加样量小 20 200 l 其准确性直接影响实验结 果 利用称重法检查 低 中 高三个刻度分别吸取指示量的水 万分之一天平称重后计算吸量是否准确 一般应在 5 以内 恒温箱 经常检查恒温箱温度计所示的温度和水中 或温箱内 实测温度是否一致 允许有 1 的误差 洗板机 每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过 2ul 人工扣板时 垫纸不湿 定期检查管孔是否堵塞 酶标仪 经常维护其光学部分 防止滤光片霉变 定期检测校正 使其保持良好的工作性能 2 2 试剂盒选择 试剂盒选择 应尽量选择正规厂家 产品经相应政府部门审核认可 试剂应从 灵敏度 特异性 精密度 稳定性 简便性 安全性及经济性作出 全面的评价 灵敏度 有二层含义 1 为试剂检出被检物质的最低量的能力 2 为试剂对大量样品中阳性检出的能力 特异性 常用交叉反应率表示 含有与待测物相近结构部份的物 质可能存在交叉反应 使测定结果升高 可能导致假阳性 所以交 叉反应是评价其质量的关键指标 精密度 ELISA试剂一般指其批内CV 其值应小于15 定量试剂 应同时考察线性范围 准确度 通过添加回收实验进行评价 简便性 指在不影响试剂的前三项指标的前题下 实验和测定步 骤越少越好 在定性试验中结果判断简单明了 定量试验结果计算 也应简单 安全性 指试剂对操作者和环境安全无害无传染性 经济性 试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低 成本而市场价格比较合理 试剂评价 需要有权威的确证方法确证的样品进行检测 3 3 样本前处理注意事项 样本前处理注意事项 3 1均质 组织样本 肉 肝食品类 切细 用绞肉机反复绞碎 混合均匀 水产样品 去除样品的非食用部分 食用部分切细 用均质器均浆 原料表面较脏时 需适当用蒸馏水清洗 蛋 鲜蛋去壳 蛋黄和蛋白充分混匀 水果 蔬菜类 先用水洗去泥沙 然后除去表面的水分 取食用部 分 3 2 振荡提取 将提取溶剂加入到装有样品的具塞容器中 振荡 使容器内的样 品与提取溶剂充分接触 以深入到样本组织内部提取待测组分 3 2 1 振荡方式 振荡器上进行上下 往返式振荡 手摇式上下振 荡 3 3 1 在组织样本中加入有机溶剂之间提取时 应边加边振荡 防 止组织凝结成团 不利于提取 3 3 2 在用有机溶剂提取过程中 如果出现乳化现象 解决的方法 有 用细头轻轻的搅拌 破坏乳化后 再重复离心 再加入适 量的提取剂 重新振荡 注意离心后的操作要保证样本的稀释倍数 不变 3 43 4 浓缩浓缩 由于净化过程中引入的溶剂 可能会降低待测组分的浓度或者不 适宜直接分析 需要去处全部有机溶剂进行溶剂转换 相当于试剂 盒前处理步骤中把样本在 60 度氮气下吹干 再用复溶液溶解干燥残 留物 浓缩方式 浓缩方式 氮气吹干除杂 压缩空气吹干除杂 注意 3 4 1 在吹干样本之前 用甲醇清洗针头 防止杂质干扰 3 4 2 在吹样本是 针头应在液面上空 避免与样本接触 防止产 生交叉污染 3 4 3 样本吹干后应立即取下 避免吹的时间过长 影响最终检测 结果 3 4 4 不同的药物 吹干后样本的保质期不同 提倡待样本回到室 温后立即复溶 3 53 5 净化净化 经过提取的待测组分 提取物中通常含有一些会干扰试剂盒中 抗原抗体反应的杂质或者是含有与待测物结构相似的杂质 将待测 组分与杂质分离的过程 我们把它称为试剂盒中样本的净化 在我 们现有的试剂盒前处理方法中涉及到的最常见的净化是 液液分配 法 比如 用复溶液溶解干燥残留物之前先加入适量的正己烷 在加 入正己烷和复溶液涡动后如果出现乳化现象 可以 60 度水浴加热 至乳化现象消失或减弱后 加大离心转速进行离心 实例 实例 A A 氟喹诺酮类药物试剂盒现有的水产样本前处理方法中 用二 氟喹诺酮类药物试剂盒现有的水产样本前处理方法中 用二 氯甲烷作为提取剂 注意 氯甲烷作为提取剂 注意 a 二氯甲烷的密度比水大 离心完后 二氯甲烷在下层 须先 用加样器吸尽上层废液后 再按要去取适量的下层吹干 b 在用加样器吸取下层的有机相时 正常操作往往取量不准确 此时最好用带有刻度 且刻度相对较准确的玻璃管来定量 c 上诉情况对有经验的试验员还可以通过灵活控制加样器来控 制取样的准确性 d 在振荡过程中要注意安全 二氯甲烷在振荡的过程中 如果 离心管盖密封性不时很好 往往容易爆开 在进行振荡时 不要让 离心管口对准自己或者其他人 避免溅到自己或者他人身上 e 试剂盒在使用前充分回温很必要 如回温不充分该项目曲线 影响较明显 B B 硝基呋喃代谢物检测过程中常见问题 硝基呋喃代谢物检测过程中常见问题 硝基呋喃代谢物有四种 3 氨基 2 唑烷基酮 AOZ 5 甲基吗 啉 3 氨基 2 唑烷基酮 AMOZ 氨基脲 SEM 和 1 氨基 2 内酰脲 AHD 在检测过程中也需要同其它项目一样进行添加回收测评 这其 中需要注意以下几个问题 a 代谢物在组织中是与蛋白呈结合状态 采用普通的有机溶剂 或缓冲液 是无法提取该代谢物的 需要用盐酸水解后才能 使呋喃类代谢物游离 所以在加入去离子 盐酸和 2 硝基 苯甲醛 2 NBA 混合均匀后 其 pH 应在 1 3 之间 否则不利 用水解代谢物 b 在衍生化过程中 温度和时间决定其衍生化产率 衍生化后 在加入氢氧化钠和磷酸氢二钾时 其 pH 应在中性左右 由 于部份样本的缓冲能力不同 所以需对其 pH 进行测定 因 为在酸性或碱性环境中 不利于呋喃类代谢物的提取回收 同时也容易出现假阳性 c 添加回收的几种误区 添加回收的几种误区 呋喃类代谢物提取过程通常分三个关键步骤 呋喃类代谢物提取过程通常分三个关键步骤 水解水解 衍生化衍生化 提取提取 1 采用标准曲线的最大标准浓度进行添加回收 如德国拜 发和我公司 AOZ 试剂盒中的第 6 个标准点 4 05ppb AMOZ 试剂盒 中的第 6 个标准点 8 1ppb 因为这些标准品是已经经过衍生化后 的标准品 不能代表样本前处理实验中的加酸水解和加衍生化试 剂衍生这两个步骤 所以就算回收率很高 但失去了实际参考价 值 2 完全依赖未衍生的代谢物标准品进行添加回收 因部份 未衍生的代谢物在配制成标准品后有一定的有效期 会存在潜在 的不稳定因素 而且添加回收仅能考证衍生化和提取两个关键点 不能验证从组织蛋白中水解呋喃类代谢物的过程 因此也有一定 的局限性 最好的评价方案 采用经 LC MS MS 确证的阴阳性样品 留作 质控样品 对检测的样本和试剂盒进行质量评价 这也是实验室 所出数据可信度最具说服力的关键点 4 4 酶标分析过程中的注意事项酶标分析过程中的注意事项 样本的检测是基于抗原抗体的反应 根据标准曲线 判定样本 最终的药物含量 它要求加样的准确性和洗板的一致性 在整个加 样的过程中注意实验室温度的恒定 保证反应在试剂盒所示的温度 下进行 4 14 1 常见加样方式常见加样方式 A 吸一打二 B 吸二打一 在实际操作过程中 提倡用 吸二打一 用这种方式 有如下 几种好处 a 加样过程中在板空内不出现或者很少出现气泡 b 提高加样速度 缩短前后样本反应的时间差 在加样的过程中还应细心注意避免出现下列现象 在加样的过程中还应细心注意避免出现下列现象 A 加样的过程中漏加或者重加 B 加样的过程中忘记更换吸头 C 样本的重加或者漏加 D 忘记记录样本的加样顺序 4 24 2 常见的洗板方式常见的洗板方式 A 洗板机洗板 B 多道孔加样器洗板 C 多孔吸头洗板 在洗板的过程中 确保每孔所加洗涤液量的均一 按说明书操作 不可过多 避免溢出板孔 污染其它样本 过少 则达不到洗涤的 效果 容易出现曲线不成线性 花板等情况 4 34 3 甩板 甩板 快速甩尽板孔内的液体 防止板孔里的液体对流或反溅回板孔 中产生交叉污染 4 44 4 拍板拍板 轻轻的在吸水纸上扣干板孔内的液体 而且吸水纸只能使用一 次 4 54 5 显色显色 值得注意的是 并非试剂盒中所规定的显色时间是绝对的 因