亲和分配基质烃基二氯亚砜法活化工艺

二氯亚砜法活化亲和分配基质上烃基 摘要摘要 用二氯亚砜 SOCL2 为烃基氯化试剂 聚乙二醇 PEG 为对象 对 亲和配基合成中基质上烃基活化的常规方法进行了改进 通过在反应体系中 引入三乙胺 使反应成为热力学上有利而大大提高了反应效率 减少了二氯亚砜的 用量 并简化了工艺操作 考察了反应温度 反应时间 二氯亚砜和三乙胺加 入量等因素对活化效果的影响 得到了活化程度较高的介质 关键词关键词 亲和分配基 羟基 二氯亚砜 三乙胺 聚乙二醇 引言引言 利用亲和作用的高度特异性形成的各种亲和纯化技术已成为生化分离 领域中强有力的工具之一 其中双水相亲和分配技术由于分离条件温和 与生物质兼容性好等优势备受关注 1 通过将亲和配基 共价结合到 成相组分上 利用成相组分的单相富集起来实现亲和分配 可以大大加 强双水相萃取过程的选择性 2 然而 由于羟基的活性太低 成相组 分 如聚乙二醇 葡萄糖等虽含有大量羟基 直接与亲和配基结合率仍 比较低 通过把羟基活化成活性基团 可明显提高配基的欧联率 因此 基质的活化在亲和配基的活化基质过程中十分关键 基质的活化方法直 接影响到配基的欧联量 然而有关基质活化方法研究的文献却很少 二氯亚砜是一种常用的羟基氯化试剂 广泛应用于亲和分配介质 制备中的基质活化 文献报道的一般方法为 基质与大大过 量的二氯亚砜在65 下反应 5 6 反应体系要求完全无水 并连 续通入氮气 反应条件复杂 而且产物活化效率低 本文选用 双水相亲和分配技术中常用的成相聚合物 聚乙二醇 PEG 为 模型对象 从反应机理入手 考察添加三乙胺 改变反应温度和时间 等条件对基质活化效果的影响 对二氯亚砜活化法进行改进和优化 羟基的二氯亚砜活化机理 8 是羟基的二氯亚砜活化反应属亲和取 代反应历程 羟基中的氧首先作为亲核剂 进攻二氯亚砜中的亲电子中 心硫 形成四面体的中间过渡态 脱去氯和氢 分子内发生重排 C O和S Cl键断裂 形成 R Cl和新的 S O键 具体反应历程如下 基质通过活化反应 将羟基转换成了活性较高的基团 羟基 C OH 键能平均值为 370kJ mol 通过活化 得到的 C Cl 键能平 均值为 317kJ mol 1 活化所得的氯化 PEG可以直接作为活化产物使用 也可用氨水溶解 得到氨基PEG 成为活性更高的活化产物 C N键 能平均值为 297kJ ol 9 由此可见 二氯亚砜可以很好地作为羟 基活化试剂使用 通过活化反应可明显提高基团的活性 有利于后续 的偶联反应 1 1 实实验验部部分分 1 1 1 1实实验验原原料料及及试试剂剂 1 聚乙二醇 PEG 浙江衢化集团生产 平均分子质量 2000 2 二氯亚砜 SOCL2 亭新化工厂产品 分析纯 3 三乙胺 Et3N 中国医药集团上海化学试剂公司 4 苯 石油醚等其他试剂均为市购分析纯 1 1 2 2 设设备备及及仪仪器器 1 设备 烧杯 5个 烧瓶 2个 移液管 1只 洗耳球 1个 量筒 1个 漏斗 1个 加热炉 1台 直管冷凝器 2个 2 仪器 抽滤机1 台 FTIR 傅氏转换红外线光谱分析仪 1 1 3 3 试试验验方方法法 将PEG置于圆底烧瓶中 在70 水浴中熔化并抽真空 除去水分 待用 从中称取 10 约2 5mol PEG于锥形瓶中 用50ml无水苯 溶解 加入三乙胺 5 10ml 约5mol 边搅拌边缓慢滴加新蒸馏过的 二氯亚砜 分批加入 继续搅拌 室温反应 5 反应有大量白色 黏稠沉淀生成 抽滤 滤液以无水乙醚沉淀 过滤干燥 重新用纯苯 溶解 无水乙醚沉淀 抽滤得沉淀物 干燥即得活化产物 称重 氯代 PEG 活化产物的氯含量采用将有机氯转化成无机氯 再用 AgNO3沉淀滴定法测定 0 最后 测熔点 1 1 4 4 表表征征 1 1 4 4 1 1 热热力力学学分分析析 化学反应中 可由自由能判据 表征反应的方向和限 度 由键能计算各步反应的热效应 通过反应前后分子的状 态及数量变化粗 略估计体系的有序程度 即熵值的变化情况 然后可根据 方程 估算 由反应机理可见 PEG 与二氯亚砜反应可分为两步历程 计算各 步反应的 如下 反应 反应 1 的大于 0 在热力学上不利 而反应 2 的小于 0 热力学上有利 因而二氯亚砜法活化反应的关键步骤在于反应 1 为了提高反应 1 的转化率 常规的解决方法有 升高 反应温度 加热有利于吸热反应的进行 二氯亚砜的沸点在 70 左 右 文献报道的反应温度一般为65 增加反应物的用量 加入 20倍过量的二氯亚砜 降低产物的浓度 在反应体系中连续通入氮 气 带走反应生成的气体 使反应平衡右移 然而 以上措施的效果 普遍不佳 一般氯取代度仅能达到0 4 0 5 PEG 1 本文对此进行了改进 反应 1 为吸热反应 并生成 HCl 如 果在体系中加入一种反应物 既能够与 反应以降低体系中的 HCl浓度 又能放出大量的反应热 将会改进反应过程 促进反应 1 平衡右移 因此 在反应体系中引入三乙胺 利用三乙胺与盐 酸反应可大量放热并迅速生成沉淀的特点 11 而使反应成为热力 学上有利 反应 3 和反应 1 协同进行 反应体系中加入三乙胺后 两步反应在热力学上均有利 从而使 羟基的活化成为动力学控制 并且 反应过程中产生的HCl气体与三 乙胺反应生成沉淀 从而无需再通氮气 可大大简化反应操作 2 2 结结果果及及讨讨论论 2 2 1 1 二二氯氯亚亚砜砜 S SO OC CL L2 2 的的加加入入量量 三乙胺 Et3N 的加入使反应在热力学上有利 随着 二氯亚 砜 SOCL2 的加入 反应体系中放出大量的热并迅速生成沉淀 容 易发生炭化现象 因此 强搅拌情况下 缓慢滴加 SOCL2是必要 的 同时对 SOCL2 的加入量进行了优化 实验表明 每批次反应中由 于反应物 PEG及溶剂苯脱水情况的稍许波动以及环境湿度的不同 SOCL2 的加入量会略有变化 一般第 1批SOCL2的加入量为 3倍过量 第2批加入量为 2倍过量 可得到较好的结果 2 2 反应温度和时间的影响 加入三乙胺后 反应成为动力学控制 反应产率与反应时间成正 比 考察了反应温度和反应时间的影响 图 给出了在不同反应温度 下活化产物的氯取代度随时间的变化关系 由图可见 在20 35和 50 3个温度下 活化率都先随着时间的增加而增大 达到最大值后 逐渐减少 对比 3个温度下的结果可见 过低或过高的温度都不利于基 质的活化 最优条件为 35 下反应 5 PEG活化产物的氯取代度可达 到1 54mol mol PEG 1 2 2 3 3 三三乙乙胺胺用用量量的的影影响响 三乙胺 Et3N 的加入是为了与反应过程中产生的HCL反应 其 加入量直接影响反应的历程 图 给出了三乙胺的加入量对产物中氯取 代度的影响 随着 三乙胺 加入量的增加 产物的氯化程度不断提高 当 Et3N的加入量达到 1 5ml时 氯取代度达到最大值 继续增加Et3N 的量 氯取代度反而有所下降 实验过程中还发现 若加入的Et3N 过多 后期处理过程中 由于反应剩余的二氯亚砜 SOCL2 逐渐水 解产生 HCL气体 与 Et3N 反应 不断有白色沉淀生成 给操作带来较大 的困难 因此 Et3N 的加入量应相当于底物所带的羟基数或略少为 宜 即在 20 PEG 约 2 5mmol 活化时 带有羟基数约为5mmol 加 入Et3N 的量为 1 3ml 约 9 4 氯取代度为1 54 mol mol PEG 为常规二氯 亚砜活化法的 3倍左右 3 3 结结 论论 在二氯亚砜活化法中 引入了三乙胺制备亲和介质与反应产物 HCl生 成Et N HCl沉淀 使反应成为热力学上有利 减少了二氯亚砜的用量 提高了反应效率 同时 HCL作为沉淀从体系中析出 使得反应体系中 无需再通入氮气 简化了反应操作 经过优化 得到最佳反应条件 加入与羟基等摩尔 或略少 的三乙胺 5倍过量的二氯亚砜 分批 加入 第一批为 3倍过量 第二批为 2倍过量 35 下反应 5 活化产物的氯取代度为1 54mol Cl mol PEG 1 参参考考文文献献 1 Hatti Kaul R Aqueous Two phase Systems a General Overview Molecular Biotechnology 2001 19 3 269 277 2 Johansson G tjerneld F Affinity Partition Between Aqueous Phases a Tool for Large scale Purification of Enzymes J Biotechnol 1989 11 135 142 3 Maria EDS Telma TF Purification of Soybean Peroxidase Glycine max by Metal Affinity Partition in Aqeous Two phase Systems J Chromatogr B 2000 743 287 294 4 Birkenmeier G Vijayalakshmi M A Stigbrand T Immobilized Metal Ion Affinitu Pareieion a Method Combing Metal Protein Interaction and Partitioning of Protein in Aqueous Two phase Systems J Chromatogr 1991 539 235 254 5 Gerhard K Gerd Birken M Affinity Partitioning and Extraction of Proteins Bioseparation 1990 1 235 254 6 Ulf S Jeff A So I folke T Affinity Partitioning of a Poly histidine tagged Integral Membrane Protein Cytochrome bo3 Ubiquinol Oxidase in a Detergent polymer Aqueoous Two phase Systerm Containing Metal chelating Polymer J Chromatogr B 2000 743 307 316 7 谭天伟 王丙武 刘德华 化学工报 1996