第十一章-荧光法解析.ppt

第十一章荧光分析法Fluoreometry 荧光 3 31 20209 22 51PM 荧光的产生 发射与激发光谱 荧光仪器 定量关系 荧光效率 概述 用荧光来进行定性定量的分析方法 荧光分析法 可见 紫外光源分子荧光分析由荧光波长可确定物质分子结构由荧光强度可测物质的含量 1荧光分析法基本原理一 分子荧光 一 分子荧光的产生分子在辐射能的照射下 电子跃迁至单重激发态 并以无辐射弛豫方式回到第一单重激发态的最低振动能级 由此再跃回基态或基态中其它振动能级时所发出的光 基态和激发态单重态和三重态辐射跃迁 光 和无辐射跃迁 热 概念 单重态 singletstate 三重态 tripletstate 电子能级的多重性M M 2S 1 S为总自旋量子数 续前 A 基态单重态B 激发单重态C 激发三重态 激发三重态T 激发单重态S 基态单重态S0 激发单重态S与激发三重态T的不同点 1 能量高2 激发单重态平均寿命短 tS 10 8s 3 基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁 1 能量低2 激发三重态平均寿命长 tS 10 4 1s 3 基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁 激发单重态S 激发三重态T 回基态途经 荧光形成机制 单重态 第二激发态 第一激发态 三重态 荧光 磷光 内转换 体系跨越 振动弛豫 基态 振动弛豫 荧光 磷光 处于第一电子激发单重态最低振动能级的分子发射光量子回到基态各振动能级 这一过程为荧光发射 处于第一电子激发三重态最低振动能级的分子发射光量子回到基态各振动能级 这一过程为磷光发射 吸收峰 磷光峰 荧光峰 二 荧光的激发和发射光谱 激发波长 发射波长 激发光谱 excitationspectrum F ex 荧光光谱 fluorescencespectrum F em 荧光光谱 固定发射波长 改变激发波长 测荧光强度和激发光波长的关系 固定激发波长 为最大激发波长 测不同波长时的荧光强度 荧光的激发光谱和发射光谱 激发光谱 200 250 300 350 400 450 500 荧光激发光谱 荧光发射光谱 nm 蒽的激发光谱和荧光光谱 蒽的激发光谱和荧光光谱 镜像关系的原因 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似 返回 荧光产生的必要条件 有吸收结构 有高的荧光效率 二 荧光与分子结构 一 荧光效率 fluorescenceefficiency 共轭高荧光效率高 刚性平面使荧光效率高 1 给电子基团使荧光增强 OH OCH3 NH2 CN NR2 2 吸电子基团使荧光减弱 COOH NO2 SH C O X 3 R SO3H NH3 等基团对荧光影响不明显 共轭效应 产生荧光的有机物质 都含有共轭双键体系 共轭体系越大 离域大 键的电子越容易激发 荧光越容易产生 荧光物质的刚性和平面性增加 有利于荧光发射 刚性平面结构 芴 联苯 F 1 F 0 2 荧光黄 不产生荧光 产生荧光 产生荧光 不产生荧光 F 0 92 荧光黄 酚酞 偶氮菲 偶氮苯 1 给电子取代基加强荧光 取代基效应 HN2 NHR NR2 OH OR CN 产生p 共轭 二苯甲酮 弱荧光S1 T1的系间窜跃产率接近1 2 吸电子取代基减弱荧光 C O COOH NO2 不产生p 共轭 硝基苯 不产生荧光 金属螯合物的荧光 1 螯合物中配位体的发光 8 羟基喹啉弱荧光 8 羟基喹啉 Zn螯合物黄绿色强荧光 2 2 二羟基偶氮苯无荧光 2 2 二羟基偶氮苯 Al螯合物强荧光 三 影响荧光强度的外部因素 A 温度影响温度上升 荧光减弱B 溶剂的影响增大溶剂的极性使荧光增强含重原子的溶剂 e g CBr4 使荧光减弱溶剂粘度降低荧光强度减弱C 酸度的影响D 荧光熄灭剂激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用 使能量转移 荧光强度减弱甚至消失 E 散射光 散射光干扰及消除 散射光 当一束平行光投射在液体试样上 大部分被吸收或透过 小部分由于光子和物质分子相碰撞 使光子的运动方向改变 而向不同方向散射形成的光 散射光包括瑞利散射光和拉曼光瑞利散射光 无能量的交换 散射 激发拉曼光 有能量转移 散射 激发 硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光 a 与散射光谱 b 荧光光谱 散射光谱 瑞利光320nm 拉曼光360nm 拉曼光400nm 荧光448nm 激发320nm 激发350nm 瑞利光350nm 干扰的消除1 改变激发光的波长 2 更换溶剂 CCL4的拉曼光与激发光波长相近 其拉曼光几乎不干扰荧光测定 2荧光定量分析方法 一 荧光强度与物质浓度的关系I0IF 在ECl 0 05时 F KC 溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系 在ECl 0 05 溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度不呈线性关系 荧光分析法的测定灵敏度高 三 分子荧光强度与荧光物质浓度的关系 1 荧光强度与浓度的关系 光吸收定律 Lambert BeerLaw 相应的吸光分数为 荧光强度 IF 与相应的吸光分数成正比 按照级数展开式 对于稀溶液 当 bc 0 05时 IF 荧光强度 F 荧光量子产率 k 与仪器灵敏度有关的参数I0 入射光强度 l 吸收光程 摩尔吸光系数C 荧光物质浓度 通常A 0 05 If与A的关系A与c正比 低浓度 泰勒级数展开 仅取一项 x越小越符合 定量关系 荧光分析法的应用 一 工作曲线法 荧光分析的灵敏度比紫外 可见分光光度法高103 104 直接荧光标准曲线法 二 荧光分析法的灵敏度 比例法 分光法与荧光法定量比较UV VIS分光法荧光法定量基础A lgI0 IF C灵敏度与 有关与 有关检测限10 6 10 910 9 10 12灵敏度高选择性好 垂直方向 3荧光光度计 紫外 可见分光光度计 荧光分光光度计 与分光光度计的主要差别 垂直测量方式 消除透射光影响 两个单色器 激发和发射 常用光栅 荧光仪特点 一 光源 1 光源的要求 发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射强度随波长的变化小有足够长的使用寿命 2 氙灯光源 常用气体放电灯类型 氙灯光源高压汞光源 波长范围 200 1000nm工作压力 5 20atm启动电压 20 40KV使用寿命 1000 2000h 最广泛应用的连续光源 发射波长范围宽发射光强度大 二 单色器 两个 三 检测器 光电倍增管放大倍数 2n 5n n 10 103 107 最大108 109 四 样品池 1 形状 紫外 可见分光光度计的吸收池两面透光荧光分光光度计的样品池四面透光 波长范围 2 使用注意事项 容易破碎 问题 紫外 可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别 沾污问题 2 发射单色器 置于样品池后和检测器之间 1 激发单色器 置于光源和样品池之间 其作用是提供所需要的单色光 以激发被测物质 紫外 可见分光光度计测量池 吸收池 荧光分光光度计样品池 I0 It I0 It IF p 4分子荧光分析法的在药学中的应用 1 无机阳离子发生荧光的很少 但很多能与一些有机试剂形成荧光络合物而被测定 2 一些阴离子能使荧光减弱 可利用荧光猝灭法测定 3 脂肪族有机物分子能发生荧光的也不多 可与某些有机试剂反应后生成会发射荧光的衍生物加以测定 4 芳香族化合物因有共轭结构 多数能发射荧光 5 弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成强荧光衍生物以提高测量灵敏度 故药物中的胺类 抗菌素 维生素 甾体类均可用荧光法测定 该法在体内药物定量分析中应用甚广 芳香族化合物存在共轭的不饱和体系 是有机化合物荧光测定的主要类型 1 荧光和磷光在产生机制上有什么不同 2 何谓荧光量子效率 哪些结构物质有较高荧光效率 3 以下物质中可能有最强荧光的物质是 思考题 4 荧光光谱分析中的最主要光谱干扰是 A 激发光 B 磷光 C 拉曼光 D 容器表面产生的散射光5 测量荧光强度时 要在与入射光成直角的方向测量 这是因为 A 只有在与入射光成直角的方向上才有荧光 B 在成直角方向测量可以避免散射光的影响 C 在成直角方向测量可免除透射光的影响 D 荧光的强度比入射光强6 荧光光谱形状与激发光的波长无关 7 荧光光谱的特征 1 所谓荧光 即指某些物质经入射光照射后 吸收了入射光的能量 从而辐射出比入射光 A 波长长的光线B 波长短的光线C 能量大的光线D 频率高的光线2 下列说法正确的是 A荧光发射波长永远大于激发波长B荧光发射波长永远小于激发波长C荧光光谱形状与激发波长无关D荧光光谱形状与激发波长有关3 荧光物质的荧光强度与该物质的浓度成线性关系的条件是 A 单色光B ECl 0 05C 入射光强度I0一定D 样品池厚度一定