第十六章色谱法分离原理介绍.ppt

第十六章色谱法分离原理 第一节概述 色谱法是一种重要的分离分析方法 它是根据组分在两相中作用能力不同而达到分离目的 1941Martin和Synge提出液 液色谱理论 1952James和Martin发展了气相色谱 1956VanDeemter提出速率理论 1967Kirkland等研制高效液相色谱法 20世纪80年代以后出现毛细管电泳和毛细管电动色谱等一系列新的色谱分析方法 1903俄国植物学家茨维特分离植物色素 t s 在色谱法中 将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相 固体或液体 称为固定相 自上而下运动的一相 一般是气体或液体 称为流动相 装有固定相的管子 玻璃管或不锈钢管 称为色谱柱 当流动相中样品混合物经过固定相时 就会与固定相发生作用 由于各组分在性质和结构上的差异 与固定相相互作用的类型 强弱也有差异 因此在同一推动力的作用下 不同组分在固定相滞留时间长短不同 从而按先后不同的次序从固定相中流出 分类 第二节色谱流出曲线及有关术语 一 色谱流出曲线和色谱峰由检测器输出的信号强度对时间作图 所得曲线称为色谱流出曲线 曲线上突起部分就是色谱峰 如果进样量很小 浓度很低 在气固 液固吸附色谱或气液 液液分配色谱的线性范围内 则色谱峰是对称的 二 基线在实验操作条件下 色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线 稳定的基线应该是一条水平直线 三 峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离 以 h 表示 色谱流出曲线和色谱峰基线 a 峰高 h 四 保留值1 死时间tM不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时 从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间 它正比于色谱柱的空隙体积 如下图 因为这种物质不被固定相吸附或溶解 故其流动速度将与流动相流动速度相近 测定流动相平均线速 时 可用柱长L与tM的比值计算 即 L tM 2 保留时间tR试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间 称为保留时间 如下图 3 调整保留时间tR 某组分的保留时间扣除死时间后 称为该组分的调整保留时间 即tR tR tM由于组分在色谱柱中的保留时间tR包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所须的时间 所以tR实际上是组分在固定相中保留的总时间 保留时间是色谱法定性的基本依据 但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响 因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值 4 死体积V0指色谱柱在填充后 柱管内固定相颗粒间所剩留的空间 色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和 当后两项很小可忽略不计时 死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fco cm3 min 1 计算 V0 tMFco式中Fco为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速 仅适用于气相色谱 不适用于液相色谱 5 保留体积VR指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积 保留时间与保留体积关系 VR tRFco 6 调整保留体积VR 某组分的保留体积扣除死体积后 称为该组分的调整保留体积 VR VR V0 tR Fco 7 相对保留值r2 1某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比 称为相对保留值 r2 1 tR2 tR1 VR2 VR1 由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关 而与柱径 柱长 填充情况及流动相流速无关 因此 它在色谱法中 特别是在气相色谱法中 广泛用作定性的依据 在定性分析中 通常固定一个色谱峰作为标准 s 然后再求其它峰 i 对这个峰的相对保留值 此时可用符号 表示 即 tR i tR s 式中tR i 为后出峰的调整保留时间 所以 总是大于1的 相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标 又称选择因子 五 区域宽度色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一 用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素 表示色谱峰区域宽度通常有三种方法 1 标准偏差 即0 607倍峰高处色谱峰宽的一半 2 半峰宽Y1 2 即峰高一半处对应的峰宽 它与标准偏差的关系为Y1 2 2 354 3 峰底宽度Y 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离 它与标准偏差 的关系是Y 4 从色谱流出曲线中 可得许多重要信息 i 根据色谱峰的个数 可以判断样品中所含组分的最少个数 ii 根据色谱峰的保留值 可以进行定性分析 iii 根据色谱峰的面积或峰高 可以进行定量分析 iv 色谱峰的保留值及其区域宽度 是评价色谱柱分离效能的依据 v 色谱峰两峰间的距离 是评价固定相 或流动相 选择是否合适的依据 色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离 组分要达到完全分离 两峰间的距离必须足够远 两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的 即与色谱过程的热力学性质有关 但是两峰间虽有一定距离 如果每个峰都很宽 以致彼此重叠 还是不能分开 这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的 即与色谱过程的动力学性质有关 因此 要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为 一 分配系数K和分配比k1 分配系数K分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配过程 而吸附色谱的分离是基于反复多次的吸附 脱附过程 这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述 而描述这种分配的参数称为分配系数K 它 K 是指在一定温度和压力下 组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值 即K 溶质在固定相中的浓度 溶质在流动相中的浓度 Cs Cm 分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的 它是每一个溶质的特征值 它仅与两个变量有关 固定相和温度 与两相体积 柱管的特性以及所使用的仪器无关 2 分配比k分配比又称容量因子 它是指在一定温度和压力下 组分在两相间分配达平衡时 分配在固定相和流动相中的物质的量比 即k 组分在固定相中的物质的量 组分在流动相中的物质的量 ns nm k值越大 说明组分在固定相中的量越多 相当于柱的容量大 因此又称分配容量或容量因子 它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数 k值也决定于组分及固定相热力学性质 它不仅随柱温 柱压变化而变化 而且还与流动相及固定相的体积有关 k ns nm CsVS CmVm式中cs cm分别为组分在固定相和流动相的浓度 Vm为柱中流动相的体积 近似等于死体积 Vs为柱中固定相的体积 在各种不同的类型的色谱中有不同的含义 例如 在分配色谱中 Vs表示固定液的体积 在尺寸排阻色谱中 则表示固定相的孔体积 分配比k值可直接从色谱图中测得 k tR tM tM t R tM V R V0 3 分配系数K与分配比k的关系K kVS VM k 其中 称为相比 它是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数 例如 对填充柱 其 值一般为6 35 对毛细管柱 其 值为60 600 滞留因子Rs 分配比k值可直接从色谱图测得 设流动相在柱内的线速度为u 组分在柱内线速度为us 由于固定相对组分有保留作用 所以us u 此两速度之比称为滞留因子Rs Rs若用质量分数表示 即 对组分和流动相通过长度为L的色谱柱 其所需时间分别为 整理得 4 分配系数K及分配比k与选择因子 的关系对A B两组分的选择因子 用下式表示 t R B t R A k A k B K A K B 通过选择因子 把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来 对固定相的选择具有实际意义 如果两组分的K或k值相等 则 1 两个组分的色谱峰必将重合 说明分不开 两组分的K或k值相差越大 则分离得越好 因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件 下图是A B两组分沿色谱柱移动时 不同位置处的浓度轮廓 图中KA KB 因此 A组分在移动过程中滞后 随着两组分在色谱柱中移动距离的增加 两峰间的距离逐渐变大 同时 每一组分的浓度轮廓 即区域宽度 也慢慢变宽 显然 区域扩宽对分离是不利的 但又是不可避免的 若要使A B组分完全分离 必须满足以下三点 第一 两组分的分配系数必须有差异 第二 区域扩宽的速率应小于区域分离的速度 第三 在保证快速分离的前提下 提供足够长的色谱柱 第一 二点是完全分离的必要条件 作为一个色谱理论 它不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率 而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素 塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提 故称为线性色谱理论 小结 色谱法研究的核心 选择最适合的色谱体系和条件 在最短的时间达到最佳的分离效果 二 塔板理论把色谱柱比作一个精馏塔 沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为 同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标 即色谱柱是由一系列连续的 相等的水平塔板组成 每一块塔板的高度用H表示 称为塔板高度 简称板高 塔板理论假设 1 在柱内一小段长度H内 组分可以在两相间迅速达到平衡 这一小段柱长称为理论塔板高度H 2 以气相色谱为例 载气进入色谱柱不是连续进行的 而是脉动式 每次进气为一个塔板体积 Vm 3 所有组分开始时存在于第0号塔板上 而且试样沿轴 纵 向扩散可忽略 4 分配系数在所有塔板上是常数 与组分在某一塔板上的量无关 简单地认为 在每一块塔板上 溶质在两相间很快达到分配平衡 然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动 对于一根长为L的色谱柱 溶质平衡的次数应为 n L Hn称为理论塔板数 与精馏塔一样 色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加 随板高H的增大而减小 根据上述假定 在色谱分离过程中 该组分的分布可计算如下 开始时 若有单位质量 即m 1 例1mg或1 g 的该组分加到第0号塔板上 分配平衡后 由于k 1 即ns nm故nm ns 0 5 当一个板体积 l V 的载气以脉动形式进入0号板时 就将气相中含有nm部分组分的载气顶到1号板上 此时0号板液相 或固相 中ns部分组分及1号板气相中的nm部分组分 将各自在两相间重新分配 故0号板上所含组分总量为0 5 其中气液 或气固 两相 各为0 25 而1号板上所含总量同样为0 5 气液 或气固 相亦各为0 25 以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时 上述过程就重复一次 见下表 塔板理论指出 第一 当溶质在柱中的平衡次数 即理论塔板数n大于50时 可得到基本对称的峰形曲线 在色谱柱中 n值一般很大 如气相色谱柱的n约为103 106 因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线 第二 当样品进入色谱柱后 只要各组分在两相间的分配系数有微小差异 经过反复多次的分配平衡后 仍可获得良好的分离 第三 n与半峰宽及峰底宽的关系式为 n 5 54 tR Y1 2 2 16 tR Y 2式中tR与Y1 2 Y 应采用同一单位 时间或距离 从公式可以看出 在tR一定时 如果色谱峰很窄 则说明n越大 H越小 柱效能越高 在实际工作中 由公式n L H和n 5 54 tR Y1 2 2 16 tR Y 2计算出来的的n和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能 因为采用tR计算时 没有扣除死时间tM 所以常用有效塔板数n有效表示柱效 n有效 5 54 tR Y1 2 2 16 tR Y 2有效板高 H有效 L n有效 因为在相同的色谱条件下 对不同的物质计算的塔板数不一样 因此 在说明柱效时 除注明色谱条件外 还应指出用什么物质进行测量 例 已知某组分峰的峰底宽为40s 保留时间为400s 计算此色谱柱的理论塔板数 解 n 16 tR Y 2 16 400 40 2 1600块 塔板理论是一种半经验性理论 它用热力学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率 解释了流出曲线的形状 并提出了计算和评价柱效高低的参数 但是 色谱过程不仅受热力学因素的影响 而且还与分子的扩散 传质等动力学因素有关 因此塔板理论只能定性地给出板高的概念 却不能解释板高受哪些因素影响 也不能说明为什么在不同的流速下 可以测得不同的理论塔板数 因而限制了它的应用 1 从理论上得到了描述色谱流出曲线的方程 通过该方程可以预测具有不同分配系数K的两种物质在塔板数为n的色谱柱上分离的情况 小结 2 通过这一方程看出影响柱效率的因素是理论板数n 其值越大 色谱峰月窄 分离效果越好 3 既然色谱分离的依据是组分在两相中的分配能力差异 因此 两相不限于液 固相 对气体成分而言 亦可是气 固项或气 液相 三 速率理论1956年荷兰学者vanDeemter 范第姆特 等在研究气液色谱时 提出了色谱过程动力学理论 速率理论 他们吸收了塔板理论中板高的概念 并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程 从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素 该理论模型对气相 液相色谱都适用 vanDeemter方程的数学简化式为H A B u Cu式中u为流动相的线速度 A B C 为常数 分别代表涡流扩散系数 分子扩散项系数 传质阻力项系数 1 涡流扩散项A在填充色谱柱中 当组分随流动相向柱出口迁移时 流动相由于受到固定相颗粒障碍 不断改变流动方向 使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动 故称涡流扩散 涡流扩散示意图 由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性 使组分在色谱柱中路径长短不一 因而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并不一致 引起了色谱峰的变宽 色谱峰变宽的程度由下式决定 A 2 dp 上式表明 A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子 有关 与流动相的性质 线速度和组分性质无关 为了减少涡流扩散 提高柱效 使用细而均匀的颗粒 并且填充均匀是十分必要的 对于空心毛细管 不存在涡流扩散 因此A 0 2 分子扩散项B u 纵向扩散项 纵向分子扩散是由浓度梯度造成的 组分从柱入口加入 其浓度分布的构型呈 塞子 状 它随着流动相向前推进 由于存在浓度梯度 塞子 必然自发的向前和向后扩散 造成谱带展宽 分子扩散项系数为B 2 Dg B u 纵向分子扩散项 指分子沿色谱柱轴向扩散引起的色谱谱带展宽 B 2 Dm 式中 弯曲因子 填充柱 1空心柱 1Dm 组分在流动相中的扩散系数 由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1 105 因此在液相色谱中B可以忽略 是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素 也称弯曲因子 它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况 Dg为组分在流动相中扩散系数 cm3 s 1 分子扩散项与组分在流动相中扩散系数Dg成正比 Dg与流动相及组分性质有关 a 相对分子质量大的组分Dg小 Dg反比于流动相相对分子质量的平方根 所以采用相对分子质量较大的流动相 可使B项降低 b Dg随柱温增高而增加 但反比于柱压 另外纵向扩散与组分在色谱柱内停留时间有关 流动相流速小 组分停留时间长 纵向扩散就大 因此为降低纵向扩散影响 要加大流动相速度 对于液相色谱 组分在流动相中纵向扩散可以忽略 3 传质阻力项Cu由于气相色谱以气体为流动相 液相色谱以液体为流动相 它们的传质过程不完全相同 1 气液色谱传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数C1两项 即C Cg C1 气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程 这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换 即进行浓度分配 有的分子还来不及进入两相界面 就被气相带走 有的则进入两相界面又来不及返回气相 这样使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡 引起滞后现象 从而使色谱峰变宽 对于填充柱 气相传质阻力系数Cg为 式中k为容量因子 由上式看出 气相传质阻力与填充物粒度dp的平方成正比 与组分在载气流中的扩散系数Dg成反比 因此 采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体 如氢气 做载气 可使Cg减小 提高柱效 液相传质过程是指试样组分从固定相的气 液界面移动到液相内部 并发生质量交换 达到分配平衡 然后又返回气 液界面的传质过程 这个过程也需要一定的时间 此时 气相中组分的其它分子仍随载气不断向柱口运动 于是造成峰形扩张 液相传质阻力系数C1为 由上式看出 固定相的液膜厚度df薄 组分在液相的扩散系数D1大 则液相传质阻力就小 降低固定液的含量 可以降低液膜厚度 但k值随之变小 又会使C1增大 当固定液含量一定时 液膜厚度随载体的比表面积增加而降低 因此 一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度 但比表面太大 由于吸附造成拖尾峰 也不利于分离 虽然提高柱温可增大D1 但会使k值减小 为了保持适当的C1值 应控制适宜的柱温 将上面式总结 即可得气液色谱速率板高方程 这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义 它指出了色谱柱填充的均匀程度 填料颗粒的大小 流动相的种类及流速 固定相的液膜厚度等对柱效的影响 2 对于液液分配色谱 传质阻力系数 C 包含流动相传质阻力系数 Cm 和固定相传质系数 Cs 即C Cm Cs其中Cm又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力 即 式中右边第一项为流动的流动相中的传质阻力 当流动相流过色谱柱内的填充物时 靠近填充物颗粒的流动相流速比在流路中间的稍慢一些 故柱内流动相的流速是不均匀 m是由柱和填充的性质决定的因子 sm是一常数 它与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关 液液色谱中固定相传质阻力系数 Cs 可用下式表示 该式与气液色谱速率方程的形式基本一致 主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计 影响柱效的主要因素是传质阻力项 综上所述 对液液色谱的VanDeemter方程式可表达为 问题 1 空心柱是否能够用于色谱分离 2 如何获得色谱最佳流速 u在上述方程各项中存在矛盾 因此 应求出最佳值 4 流动相线速度对板高的影响 1 LC和GC的H u图根据vanDeemter公式作LC和GC的H u图 LC和GC的H u图十分相似 对应某一流速都有一个板高的极小值 这个极小值就是柱效最高点 LC板高极小值比GC的极小值小一个数量级以上 说明液相色谱的柱效比气相色谱高得多 LC的板高最低点相应流速比起GC的流速亦小一个数量级 说明对于LC 为了取得良好的柱效 流速不一定要很高 2 分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献较低线速时 分子扩散项起主要作用 较高线速时 传质阻力项起主要作用 其中流动相传质阻力项对板高的贡献几乎是一个定值 在高线速度时 固定相传质阻力项成为影响板高的主要因素 随着速度增高 板高值越来越大 柱效急剧下降 分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献 5 固定相粒度大小对板高的影响粒度越细 板高越小 并且受线速度影响亦小 这就是为什么在HPLC中采用细颗粒作固定相的根据 当然 固定相颗粒愈细 柱流速愈慢 只有采取高压技术 流动相流速才能符合实验要求 固定相粒度大小对板高的影响 第四节分离度 分离度R是一个综合性指标 分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标 称总分离效能指标 分离度又叫分辨率 它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值 即R 2 tR2 tR1 W1 W2 R值越大 表明相邻两组分分离越好 一般说 当R 1时 两峰有部分重叠 当R 1时 分离程度可达98 当R 1 5时 分离程度可达99 7 通常用R 1 5作为相邻两组分已完全分离的标志 图1表示不同分离度时色谱峰分离的程度 基本的色谱方程的表达式 P372 1 分离度与柱效的关系 由分离方程式看出 具有一定相对保留值 的物质对 分离度直接和有效塔板数有关 说明有效塔板数能正确地代表柱效能 而分离方程式表明分离度与理论塔板数的关系还受热力学性质的影响 当固定相确定 被分离物质对的 确定后 分离度将取决于n 这时 对于一定理论板高的柱子 分离度的平方与柱长成正比 即 说明用柱长的色谱柱可以提高分离度 但延长了分析时间 因此 提高分离度的好方法是制备出一根性能优良的柱子 通过降低板高 以提高分离度 2 分离度与选择因子的关系由基本色谱方程式判断 当 1时 R 0 这时 无论怎样提高柱效也无法使两组分分离 显然 大 选择性好 研究证明 的微小变化 就能引起分离度的显著变化 一般通过改变固定相和流动相的性质和组成 可有效增大 值 5 基本色谱分离方程式的应用在实际中 基本色谱分离方程式是很有用的公式 它将柱效 选择因子 分离度三者的关系联系起来了 知道其中两个指标 就可计算出第三个指标 例18 1 有一根lm长的柱子 分离组分1和2得到如图18d5的色谱图 图中横坐标l为记录笔走纸距离 若欲得到R 1 2的分离度 有效塔板数应为多少 色谱往要加到多长 解 先求出组分2对组分1的相对保留值r2 1 即 值 求有效塔板数neffneff 16 0 8 2 1 1 1 1 1 2 1239若使R 1 2 所需塔板数可计算 即 因此 欲使分离度达