第四章-培养基灭菌与空气净化.ppt

第四章培养基灭菌与空气净化 第一节培养基灭菌的目的 要求和方法第二节培养基的湿热灭菌第三节空气净化 除菌 第一节培养基灭菌的目的 要求和方法 一 定义1 培养基灭菌指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子 或从中将其除去 工业规模的液体培养基灭菌 杀灭杂菌比除去杂菌更为常用 2 灭菌与消毒的区别灭菌 用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物 包括营养细胞 细菌芽孢和孢子 消毒 用物理或化学方法杀死物料 容器 器皿内外的病源微生物 一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢 消毒不一定能达到灭菌要求 而灭菌则可达到消毒的目的 1 在发酵过程中杂菌造成的后果 生产菌和杂菌同时生长 生产菌丧失生产能力 在连续发酵过程中 杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得更快 结果使发酵罐中以杂菌为主 杂菌及其产生的物质 使提取精制发生困难 杂菌会降解目的产物 醋酸菌氧化乙醇杂菌会污染最终产品 酿酒干酵母的杂菌发酵时如污染噬菌体 可使生产菌发生溶菌现象 二 培养基灭菌的目的 1 使用的培养基和设备须经灭菌 2 好氧培养中使用的空气应经除菌处理 3 设备应严密 发酵罐维持正压环境 4 培养过程中加入的物料应经过灭菌 5 使用无污染的纯粹种子 2 工业上控制杂菌的措施 3 培养基灭菌的目的杀灭培养基中的所有微生物 为后续发酵过程创造无菌的条件 4 培养基灭菌的要求达到要求的无菌程度 10 3 尽量减少营养成分的破坏 在灭菌过程中 培养基组分的破坏 是由两个基本类型的反应引起的 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解 培养基中不同营养成分间的相互作用 羰氨反应 化学法化学药品灭菌法物理法射线灭菌法 紫外线或电离辐射空气的过滤除菌干热灭菌法湿热灭菌法 高温灭菌 三 灭菌的方法 酒精 SO2 连 苯并芘 关于灭菌和消毒的不正确的理解是 A 灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞 芽孢和孢子B 消毒和灭菌实质上是相同的C 接种环用灼烧法灭菌D 常用灭菌的方法有加热法 过滤法 紫外线法 化学药品法 谷氨酸棒状杆菌的培养液常采用的灭菌方法是 A 高压蒸汽灭菌B 高温灭菌C 加入抗生素灭菌D 酒精灭菌 防腐 antisepsis 防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖 从而达到防止食品等发生霉腐的措施 1 低温 4 高渗 2 缺氧 5 高酸度 3 干燥 6 防腐剂 一 湿热灭菌的原理每一种微生物都有一定的生长温度范围 当微生物处于最低温度以下时 代谢作用几乎停止而处于休眠状态 当温度超过最高限度时 微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性 使微生物在很短时间内死亡 蒸汽具有很强的穿透能力 而且在冷凝时会放出大量的冷凝热 很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物 第二节培养基的湿热灭菌 蒸汽来源容易 操作费用低 本身无毒 蒸汽有强的穿透力 灭菌易于彻底 蒸汽有很大的潜热 操作方便 易管理 湿热灭菌的优点 湿热灭菌中的相关概念 某些微生物对湿热的相对热阻 与大肠杆菌比较 杀死微生物的极限温度称为致死温度 致死温度 Deathtemperature 热力致死时间 ThermalDeathTime TDT 在特定条件 特定温度下 杀死某种微生物所需的最短时间 e g伤寒杆菌58 30min变形杆菌55 60min 利用一定温度进行加热 90 的活菌被杀死时所需的时间 min 即为D值 又称1 10衰减时间 D D 10min 0102030405060 加热时间 min 105 104 103 102 10 106 残存活细胞数 残存活细胞曲线 D值 例 含有某种细菌的悬液 含菌数为105 mL 在100 212 F 的水浴温度中 活菌数降低到104 mL时所需的时间为10min 则该菌的D值即为10min D100 10min如果加热的温度为121 则常写成Dr 在加热致死时间曲线中 加热时间缩短90 所需升高的温度 即为Z值 100115 100 10 加热时间 min 加热温度 加热致死时间曲线 Z Z 15 Z值 2 303 k log No Ns 灭菌时间 s k 反应速度常数 与菌的种类和加热温度有关 s 1 No 灭菌开始时 污染的培养基中杂菌个数 个 mL Ns 经过灭菌时间T后 残存活菌个数 个 mL 二 理论灭菌时间 可见灭菌时间取决于污染程度 N0 灭菌程度 残留菌数Ns 和 值 在培养基中有各种各样的微生物 不可能逐一加以考虑 一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据 灭菌程度 即残留菌数 如果要求完全彻底灭菌 即N 0 则 为 上式无意义 事实上也不可能 一般取N 0 001 即1000次灭菌中有1次失败 例 有一发酵罐内装40m3培养基 在121 温度下进行实罐灭菌 原污染程度为每mL有2 105个耐热细菌芽孢 121 时灭菌速度常数为1 8min 1 求灭菌失败几率为0 001时所需的灭菌时间 将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中 通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程 也称实罐灭菌 一 间歇灭菌 常用 三 灭菌操作 240 160 120 80 时间 min 0 50 100 150 温度 升温 冷却 保温 培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况 过程包括 升温 保温和冷却三阶段 各阶段对灭菌的贡献 20 75 5 发酵罐 蒸汽 蒸汽 冷却水 无菌培养基 配料罐 泵 加热塔 维持罐 冷却管 二 连续灭菌 又称连消 将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行加热 保温和冷却而进行灭菌 连续灭菌的基本设备有哪些 问题 连续灭菌过程 连续灭菌的流程与设备 1 配料预热罐 将配制好的料液预热到60 70 以免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声 2 连消塔 用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌温度 126 132 配料罐 兼作预热 输料泵 连消塔 器 维持罐 管 冷却器 发酵罐 3 维持罐 使料液在灭菌温度下保持5 7min 因为 连消塔加热的时间很短 光靠这段时间的灭菌是不够的 4 冷却管 使料液冷却到40 50 后 冷水喷淋 输送到预先灭菌过的罐内 连续灭菌过程中温度的变化 虚线 三 间歇灭菌与连续灭菌的比较 四 影响培养基灭菌的主要因素 1 微生物热阻 2 pH 微生物在pH6 0 8 0范围内耐热性最大 pH低于6 0时 氢离子极易渗入微生物细胞 从而改变细胞的生理反应而促进其死亡 故培养基酸度愈高 则所需的杀菌时间愈短 温度孢子数灭菌时间 min 个 ml pH 6 15 35 04 74 5120100008753311510000252516131311010000706535302410010000740720180150150 pH对灭菌时间的影响 3 菌的浓度 浓度越高 所需灭菌时间越长 4 培养基成分 油脂 糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性因高浓度有机物会环绕细菌的四周形成一层薄膜 影响热的传入 而高浓度的盐类 色素等则削弱其抗性 浓度较高的培养基相对需要较高温度和较长时间灭菌 5 泡沫泡沫中的空气形成隔热层 使热量难以渗透进去杀死其中潜伏的微生物 易产生泡沫的培养基在灭菌时 可加入少量消泡剂 6 颗粒颗粒小 灭菌容易 颗粒大 灭菌难 五 发酵罐的灭菌 培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法 则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌 通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或盘管 并从空气分布管中通入蒸汽 充满整个容器后 再从排气管中缓缓排出 容器内的蒸汽压力保持1公斤 20分钟 在保温结束后 关键是随即通入无菌空气 使容器保持正压 防止形成真空而吸入带菌的空气 六 补料液的灭菌 在发酵过程中 往往要向发酵罐中补入各种不同的料液 这些料液都必需经过灭菌 灭菌的方法则视料液的性质 体积和补料速率而定 如果补料量较大 而具有连续性时 则采用连续灭菌较为合适 也有利用过滤法对补料液进行除菌 补料液的分批灭菌 通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽 所有的附属设备和管道都要经过灭菌 无菌空气的概念发酵工业应用的 无菌空气 是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数 从而能控制发酵污染至极小机会 发酵对空气无菌程度的要求一般按染菌机率为10 3 来计算 即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许1 2次染菌 第三节空气净化 除尘 除水 除菌 空气中微生物的分布 空气中的含菌量随环境不同而有很大差异 地域 一般干燥寒冷的北方空气中的含菌量较少 而潮湿温暖的南方则含菌量较多 人口 人口稠密的城市比人口少的农村含菌量多 空间 地面又比高空的空气含菌量多 各地空气中所悬浮的微生物种类及比例各不相同 数量也随条件的变化而异 一般设计时以含量为103 104个 米3进行计算 空气中微生物 包括细菌 酵母 霉菌和病毒 一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上 灰尘粒子的平均大小约0 6 m左右 空气除菌主要去除空气中的微粒 0 6 1 m 空气除菌的方法 一 辐射杀菌 二 热杀菌 三 静电除菌 四 过滤除菌 介质 一 辐射灭菌1 原理 射线 X射线 射线 射线 紫外线 超声波等从理论上讲都能破坏蛋白质 破坏生物活性物质 从而起到杀菌作用 2 应用范围通常用于无菌室和医院手术室 3 缺点杀菌效率较低 杀菌时间较长 一般要结合甲醛蒸汽等来保证无菌室的无菌程度 紫外线对人体组织有一定刺激作用 眼睛 皮肤受照射后会产生某些症状 二 加热灭菌 电热 218 24s 效果可达99 9999 目前大量处理空气 技术上还有困难 三 静电除菌1 原理利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘 除菌的目的 2 优点阻力小 约1 01325 104Pa染菌率低 平均低于10 15 除水 除油的效果好耗电少3 缺点设备庞大 一次性投资较大 捕集率尚嫌不够 需要采取其它措施 需高压电 一般用于超净台 四 空气过滤除菌的原理与介质 滤材 孔 使空气通过多孔介质 如棉花 活性炭 烧结玻璃 超细纤维丝等 将空气所携带的尘 菌截阻 这是目前发酵工业中最广泛使用的方法 定义 1微米 m 等于 10 6米 10 3毫米3 9 10 5英寸又称 micron 微米 定义 小颗粒的相对尺寸 小颗粒的相对尺寸 1 过滤除菌的种类绝对过滤 过滤介质的滤孔小于细胞和孢子 如聚乙烯醇缩甲醛树脂 PVF 制成的0 3 m的微孔滤膜 深层介质过滤 介质的孔隙一般大于微生物细胞 如用棉花 玻璃纤维和颗粒活性炭填充的过滤器 如 棉花纤维直径16 20 m 充填系数为8 时 所形成的网格空隙为20 50 m 2 深层介质过滤的原理微粒随气流通过滤层时 由于滤层纤维的层层阻碍 使气流出现无数次改变运动速度和方向的绕流运动 引起微粒与滤层纤维间产生惯性冲击 拦截 布朗扩散 重力沉降 静电引力等作用把微粒滞留在纤维表面上 实现过滤的目的 直接拦截 颗粒大于孔 绝对截留 颗粒被捕获在滤材纤维之间形成的孔中 通过搭桥作用 尺寸小于滤孔的颗粒也可被拦截不规则形状的颗粒 方向性多个颗粒同时撞击到同一个滤孔 不规则形状的搭桥 多个小颗粒的搭桥 尺寸小于滤材孔径的颗粒的辅助拦截方式 惯性撞击 当微生物等颗粒随空气以一定速度流动 在接近纤维时 气流碰到纤维而受阻 空气就改变运动方向绕过纤维继续前进 但微生物等颗粒由于具有一定质量 在以一定速度运动时具有一定惯性 碰到纤维时 由于惯性作用而离开气流碰到纤维表面上 由于摩擦 粘附作用 被滞留在纤维表面上 在气体中比在液体中更有效 对大于0 5 1 0微米的颗粒很有效 当气流速度达到一定时 惯性冲击滞留作用是介质过滤的主要作用 惯性撞击 惯性撞击 吸附 范德华力 VanderWaals 拦截尺寸小于滤孔的颗粒 表面相互作用 电荷不同 许多微生物和孢子都带有电荷 具有一定速度的气流通过介质滤层时 由于摩擦作用而产生诱导电荷 当菌体所带电荷与介质电荷相反时 即发生静电吸引作用 气体分子 作随机运动 碰撞小颗粒或雾滴小微粒布朗运动 Brownianmotion 碰撞的结果 增加了颗粒碰撞过滤介质的机会仅在气体中有效 扩散拦截 气体过滤器能够去除尺寸远小于液体精度的污染物对小 细颗粒 0 1 0 3微米 非常有效如果一个气体过滤器在湿润环境中运行 它的去除能力即变为液体精度 扩散拦截 扩散拦截 气体分子作布朗运动 扩散拦截 被随机运动的气体分子碰撞的颗粒撞击到过滤介质上并被吸附截留 过滤机理总结 直接拦截 惯性撞击 扩散拦截 3 空气过滤除菌介质 纤维状或颗粒状过滤介质棉花 常用 有弹性 纤维长度适中 玻璃纤维 直径小 不易折断 过滤效果好 8 19 m活性炭 要求质地坚硬 颗粒均匀 3mm 长5 10mm 圆柱状 有较大的表面积 通过物理吸附作用而吸附微生物 玻璃纤维 活性炭 纸类过滤介质 超细玻璃纤维纸 1 1 5 m3 6张叠在一起使用 过滤效率高 压降小 缺点 强度不大 特别是受潮后 五 发酵生产中制备无菌空气的大致过程 不同的发酵 不同的工厂采用的工艺不尽相同 两级冷却 加热除菌流程图 1 粗过滤器2 压缩机3 贮罐4 6 冷却器5 旋风分离器7 丝网分离器8 加热器9 总过滤器 冷热空气直接混合式除菌流程图 1 粗过虑器2 压缩机3 贮罐4 冷却器5 丝网分离器6 总过滤器 高效前置过滤流程图 高效前置过滤器 压缩机 贮罐 冷却器 丝网分离器 加热器 过滤器 1 空气的预处理目的 提高压缩前空气的洁净度去除压缩后空气中的油和水 1 提高压缩前空气的洁净度提高空气吸气口的位置 在空气入口处设置粗过滤器 高空取气管 为远离地面几十米的管子 每升高10米 空气中杂菌降低一个数量级 因此从高空取气要比从低空取气有利得多 粗过滤器 作用 主要是捕集较大的灰尘颗粒 并保护空压机 型式 布袋式过滤器油浴洗涤过滤器水雾除尘过滤器填料式过滤器旋风分离式过滤器等 要求 过滤效率高 阻力小 阻力大则增加空压机的吸入负荷 降低压缩空气的排出量 大气中的微生物多依附于尘埃颗粒上 将滤布缝制成与骨架相同形状的布袋 绷紧缝于焊接在进风口的骨架上 多用毛质绒布或合成纤维滤布 滤布应定期更换 结构简单 过滤效率高 但过滤阻力大 布袋式过滤器 油浴洗涤过滤器 空气通过油箱中的油层洗涤 空气中的微粒被油黏附而逐渐沉降于油箱底部而被除去 百叶窗式的圆盘可分离大滴油雾 过滤网分离小颗粒油雾 效果好 但耗油多 水雾除尘过滤器 空气从设备底部进口管吸入 经装置上部喷下的水雾洗涤 空气中的灰尘 微生物微粒被黏附沉降 从器底排出 空气流速1 3m s 太高则带入水雾太多 降低空压机的排气量 2 空气压缩和压缩空气的冷却空气压缩 克服输送过程中过滤介质的阻力并维持一定的气流速度 压缩后空气温度显著上升 需冷却 冷却原因压缩后的高温空气能引起过滤介质的炭化或燃烧增大发酵罐的降温负荷增加发酵液水分的蒸发 影响微生物生长一般用列管式冷却器进行冷却 空气贮罐 大小 应和空压机的排气量相配套V 0 1 0 2WV 贮罐容积 m3W 排气量 m3 min 作用 消除空压机排出空气量的脉动维持稳定的压力分离