大连理工大学-生化实验报告——模版(新)

说明 下面黄色标注的为必须改的地方 其他地方自己酌情修改 2013 年生物化学实验年生物化学实验 B 实验报告实验报告 姓姓 名 名 学学 号 号 实验时间 实验时间 2013 年年 10 月月 20 日日 实验分组 实验分组 第七组第七组 组内成员 组内成员 任课教师 任课教师 小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活测定 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 SDS PAGE 电泳法测定蛋 摘要摘要 本实验通过从小牛肠中提取小牛肠碱性磷酸酶 利用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 并测定酶的活性 最后通过 SDS 聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量 关键词关键词 小牛肠碱性磷酸酶提取 酶活测定 考马斯亮蓝法 SDS PAGE 电泳法 本实验分为三部分 先通过对牛小肠内膜的刮取 离心 沉淀析出等方法 提取牛小肠碱性磷酸酶 然后 用考马斯亮蓝 G 250 与碱性磷酸酶结合 利用紫外分光光度计在一定波长下测定结合物的吸收波长 根据其吸 光度与蛋白质结合物的含量成正比的关系测定蛋白质含量 进而测定出蛋白质的比活力 最后 通过 SDS 聚丙 烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量 分析所获得的电泳结果来推算出被测蛋白质分子量的近似值 1 实验部分实验部分 1 11 1 试剂与仪器试剂与仪器 1 1 1 小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定 1 试剂 1 正丁醇 丙酮 置 20 冰箱保存 2 1mol L 醋酸 HAC 1mol LNaOH 硫酸铵 3 平衡缓冲液 0 01mol LTris HCL PH 8 0 含 1 0 10 3mol LMgCl2 和 1 0 10 5mol LZnCl2 4 底物缓冲液 1mol L 二乙醇胺 盐酸缓冲液 PH9 8 含 0 5 10 3mol LMgCl2 5 酶的底物溶液 用底物缓冲液配制 15 10 3mol L 对硝基苯磷酸二钠溶液 已加入底物缓冲液中 2 仪器 匀浆机 冷冻离心机 恒温水浴 紫外可见分光光度计 离心管 剪刀 载玻片 不锈钢盘 搪瓷盘 滤 布 漏斗 分液漏斗 量筒 烧杯 移液枪 比色皿 1 1 2 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 1 试剂 考马斯亮蓝 实验小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定所得酶液 生理盐水 2 仪器 分光光度计 分析天平 玻璃比色杯 试管及试管架 移液枪 1 1 3 SDS PAGE 电泳法测定蛋白质相对分子质量 1 试剂 1 30 丙烯酰胺 acrylamide Acr 置棕色瓶 2 分离胶缓冲液 1 5mol LTris HCL 缓冲液 pH8 8 已加入 10 SDS 3 浓缩胶缓冲液 0 5mol LTris HCL 缓冲液 pH6 8 已加入 10 SDS 4 10 过硫酸铵 AP 小离心管装 提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合所必须的自由基 须新鲜配置 5 TEMED 四甲基乙二胺 小离心管装 T 通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的 聚合 6 上扬缓冲液 小离心管装 S 称 100mgSDS 2mg 溴酚蓝 2g 甘油 加 0 1mL 巯基乙醇 2mL 5mol LpH8 0Tris HCL 加超纯水定容至 10mL 7 染色液 配置含 0 1 考马斯亮蓝 R250 40 体积分数 甲醇和 10 体积分数 冰醋酸的染色液 500mL 过滤后备用 8 脱色液 500mL10 体积分数 甲醇和 10 体积分数 冰醋酸的脱色液 1000mL 9 电泳缓冲液 含 0 1 SDS 0 05mol LTris 0 384mol L 甘氨酸 pH8 3 2 仪器 电泳仪 电泳槽 制胶板 摇床 移液枪 1 21 2 实验过程实验过程 1 2 1 小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定 1 酶的分离提纯 1 取新鲜小牛肠 用剪刀纵向剖开 用载玻片刮去小肠内粘膜 放到盘子一角 2 统一将小肠黏膜液集中倒入匀浆机中 加 1 5 倍体积冰冷蒸馏水 高速匀浆 15s 重复 20 次 3 缓慢加入 总体积 1 倍体积的冰冷正丁醇 高速匀浆 15s 重复 20 次 每组领取 60mL 的匀浆液 放入离心管中 离心管装液量不能超过 70 用另一离心管用水配平 切记离 心前连同离心管盖子一起用天平配平 在 4 条件下 10000rpm 离心 15min 离心管对称放置 4 用滤布过滤去除杂质 滤饼 倒入分液漏斗中 静止分层 勿摇 去下层水相 用 1mol LHAc 调 pH 到 4 9 4 10000rpm 离心 10min 5 得到上清 26 5mL 放入离心管中 用 1mol LNaOH 调 pH 至 6 5 称取质量为溶液体积 5 的硫酸铵 1 33g 5g 硫酸铵 100mL 溶液 加到离心管中溶解 再加 0 47 倍体积 12 45mL 冰冷丙酮 混匀 4 冰箱 中 静置 30min 以上 4 10000rpm 离心 10min 6 上清液 36 5mL 中加入 1 07 倍体积 39 06mL 冰冷丙酮 4 静置 30min 以上 4 10000rpm 离心 10min 7 取沉淀溶于 2mL 平衡缓冲液至全部溶解 置冰箱保存待用 2 底物处理 底物 对硝基苯磷酸二钠已溶于平衡缓冲液中 37 水浴 5min 注意 根据分光光度计使用情况 要检 测前加热 3 酶活检测 1 将酶稀释 10 倍 配制取 10 L 溶于 90 L 平衡缓冲液中得到 2 紫外分光光度计检测条件 405nm 波长 测定时间 60s 取值 2s 记录范围 0 0 1 5 3 取 2 个 2mL 比色皿 0 5cm 光程 加入 1 5mL 上述 2 加热的底物缓冲液 校对归零 4 将稀释 10 倍的酶液 10 L 加到其中 1 个比色皿中 仪器外侧 用手堵住皿口 快速上下倒 2 次 放回 分光光度计中 测定没动力学曲线 1 2 2 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 1 玻璃试管中加入 5mL 考马斯亮蓝 2 在 1 5mL 离心管中 取上一实验得到的酶液分别稀释 50 100 200 倍 3 各取 100 L 加入到 5mL 考马斯亮蓝试管中 混匀 反应 5min 以上 另各取 100 L 生理盐水分别加入 到 5mL 考马斯亮蓝试管中 观察蓝色 以浅蓝色为好 4 紫外分光光度计检测条件 595nm 波长 5 取 2 个比色皿 1cm 光程 加入考马斯亮蓝 比色皿的 2 3 分光光度计中校对归零 6 将样品放入外侧比色皿中 读吸光值 得到医治蛋白浓度标准曲线范围内的度数即可 0 1 0 5 之间 7 根据蛋白浓度标准曲线 计算酶蛋白浓度 乘以相应稀释倍数即得原始酶液蛋白浓度 注意单位 1 2 3 SDS PAGE 电泳法测定蛋白质相对分子质量 1 装板 将垂直板型电泳的玻璃片洗净 晾干 放好胶条 棱朝上 平铺 用夹子夹好玻璃板 上面插 上梳子 注意下面 2 个夹子要水平 两侧夹子离梳子底部 1 0 5cm 表明分离胶加的位置 垂直放置在水平台 面上备用 2 制备分离胶 在小烧杯中按下表配置所需浓度的分离胶 注意 最后加入 TEMED 应快速摇匀分离胶 向玻璃板间隙 沿着长玻璃板的内侧缓慢注胶 然后再用移液枪慢 慢移动注入乙醇 200 L 以防止氧气进入胶内 15min 后 分离胶和乙醇之间出现分界线 表明分离胶凝固 倒出乙醇 3 制备凝缩胶 在小烧杯中按下表配置所需浓度的浓缩胶 浓缩胶制备 浓度 5 制备量 6mL 试剂用量 H2O3 4mL 30 丙烯酰胺 1 0mL 0 5mol LTris HCL 缓冲液 pH6 8 1 5mL 10 过硫酸铵 60 L TEMED8 L 注意 一旦加入 TEMED 应快速摇匀浓缩胶 在已凝固的分离胶层上加浓缩胶 立即将梳子插入胶液顶部 避免 进入气泡 放置约 20min 待浓缩胶凝固 4 蛋白质样品处理 小离心管装 B 在 1 5mL 离心管中按 1 1 体积比例 加样品和上样缓冲液 200 L 200 L 100 加热 3min 使蛋白变性 5 浓缩胶完全聚合后 去掉夹子和胶条 拔去梳子 注意不要产生气魄 即电泳泳道 将凝胶玻璃板固 定于电泳装置内槽上 加入电泳缓冲液 内 外槽 查漏 缓冲液高过玻璃板凹面 6 用移液枪依次在泳道加样 5 个 20 L 4 个 40 L 本组将 marker 置于第六泳道 7 电泳 连接正 负极 打开电源 稳压 130V 或电流 50 60mA 开始时 电流控制在 40A 样品进入分 离胶后 缓慢升高电压至 140V 或电流 50 60mA 保持电压或电流强度不变 带溴酚兰指示剂迁移至下沿处 停止 电泳 需 1 5h 左右 8 剥胶染色 电泳结束后 取出凝胶玻璃板 用水冲洗 用金属片从玻璃两侧轻轻撬开 使板内进入空气 同时用水冲洗 取出凝胶板 将剥离下来的凝胶用水漂洗 转入染色缸中 加染色液 至摇床染色 15min 9 脱色 染色完毕 回收染色液 用水漂洗 加入脱色液 置摇床脱色 30min 换 1 次脱色液 脱色至背 景清晰 10 观察测定蛋白的迁移率及条带 对照标准样品 分析蛋白样品的分子量及纯度 11 拍照电泳结果 用于完成实验报告 2 2 结果与讨论结果与讨论 2 12 1 小牛肠碱性磷酸酶的酶活测定小牛肠碱性磷酸酶的酶活测定 碱性磷酸酶酶活定义 在 37 条件下 以每分钟催化水解 1 mol 底物的酶量为一个酶活力单位 分离胶制备 浓度 10 制备量 10mL 试剂用量 H2O4 1mL 30 丙烯酰胺 3 4mL 1 5mol LTris HCL 缓冲液 pH8 8 2 4mL 10 过硫酸铵 100 L TEMED10 L 碱性磷酸酶作用于缓冲液中的对硝基苯磷酸二钠 使之水稀释放出对硝基苯酚 后者在 405nm 光波长下有 最大吸收 通过测定吸光值的变化率 可测知酚的生成量 从而计算出酶的活性单位 酶活力的计算 比活力 U mg L C V E D V A min E405 R 1 由实验小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定中实验步骤可知 反应液的体积 R V1 5mL 稀释倍数 D10 405nm 波长下对硝基苯酚的摩尔消光系数 405 Ecm 18 3L mol 所加酶液体积 E V0 01mL 比色皿光程 L0 5cm 2 405nm 波长下的吸光值的变化率通过分光光度计测量得到酶动力学曲线 图 1 可以得到 A min 0 6179 根据图片 自己估算斜率 注意单位 看后删除 说明 图片均要用自己的 半栏图片宽为 8 15 厘米 高为 4 4 5 5 厘米之间 对于特别大的图可加大宽度 通栏图片宽度为 16 3 厘 米 高为 4 4 5 5 厘米之间 图说为字号为小 5 号黑体字 表注用小 5 号字 表字用 6 号字 图 1 酶动力学曲线 3 蛋白质原始浓度 C 可由实验考马斯亮蓝法测定蛋白质含量获得 考马斯亮蓝 G 250 测定蛋白质含量属于燃料结合法的一种 在一定蛋白浓度范围内 0 01 1 0mg mL 蛋 白质 色素结合物在 595nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比 故可用于蛋白质的定量测量 通过实验 利用紫外分光光堆积测定稀释 50 倍的酶液读得吸光值为 0 1478A 利用考马斯亮蓝常量法测蛋 白质标准曲线 图 2 及其标准曲线拟合解析式 y 0 697x 0 007 得稀释后的标准蛋白浓度为 0 2221mg mL 故蛋白质原始浓度 C 50 0 2221mg mL 11 105mg mL 图 2 考马斯亮蓝常量法测蛋白质标准曲线 4 利用公式 计算比酶活 比活力 U mg L C V E D V A min E405 R 0 5cm L11 105mg m 0 01mL cm 18 3L mol L10 1 5m 0 6179 9 122U mg 综上 通过实验测定小牛肠碱性磷酸酶的比活力是 9 122U mg 2 22 2 SDS PAGESDS PAGE 电泳法测定蛋白质相对分子质量电泳法测定蛋白质相对分子质量 在 SDS PAGE 电泳中 加入一定量的 SDS 形成蛋白质 SDS 复合物 使蛋白质丧失了原有的电荷状态 形成 了仅保持原有分子大小为特征的负离子团 从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异 此时 蛋白质分子的电泳迁移率取决于蛋白质的分子量大小 而其他因素对对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计 通过进行实验 SDS PAGE 电泳法测定蛋白质相对分子质量 观察获得的电泳结果 图 3 可以测定蛋白的迁 移率及条带 图 3 电泳结果 对照标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线 图 4 及各低分子量蛋白的组成 图 5 分析知 mark 中出现了五条蛋白质标记线 根据其间距及参考文献中给出的 mark 泳道各条蛋白质标记线间距 可判定由上到 下 mark 泳道中的五条蛋白质标记线分别是牛血清白蛋白 兔肌动蛋白 牛碳酸杆菌酶 胰蛋白酶抑制剂及鸡蛋 清溶菌酶 其中样品蛋白质标记线与兔肌动蛋白 43 000g mol 和牛碳酸杆菌酶 31 000g mol 迁移率相近 所以样品的分子量与牛血清白蛋白和兔肌动蛋白分子量相近 即样品的分子量大致为 39 000g mol 这里自己 判断 每个人视力不一样 图 4 用低分子量标准蛋白质所做的标准曲线 图 5 低分子量标准蛋白组成 参考文献参考文献 可以自己调下顺序 1 Laemmli U K Nature 227 680 1970 2 张龙翔等 生化实验方法和技术 人民教育出版社 北京 1981 3 考马斯亮蓝法快速测定乳品中蛋白质含量 山东科学 J 2011 24 6 4 修志龙等 生物化学 M 化学工业出版社 2008 孙士青等 5 栾雨时 包永明 生物工程实验技术手册 M 化学工业出版社 2005 6 许文涛等 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳快速染脱色方法的比较研究 食品科学 J 2004 Vol 25 No 增 The calf intestinal alkaline phosphatase of extraction and determinatio