扫描电镜与透射电镜样品制作(完全版)

相关仪器的信息 透射电镜 JEOL 公司 JEM 1230 型号 TEM 产地 日本 超薄切片机 Reichert Jung Ultracut E ultramicrotome 产地 奥地利 扫描电镜 Philips XL30 ESEM 产地 捷克 临界点干燥仪 Hitachi HCP 2 Critical point dryer 产地 日本 真空喷镀仪 Eiko IB5 ion coater 产地 日本 包埋剂 SPI CHEM Spurr resin 产地 USA TEM 样样品包埋品包埋块块制作制作有有关关注注意意事事项项 取取材材 1 动动作作迅迅速速 组组织织离离体体后后 应应将将其其快快速速放放入入固固定定液液中中 使使组组织织细细 胞胞尽尽可可能能保保持持原原来来的的生生活活状状态态 2 减减少少损损伤伤 选选择择锋锋利利切切割割器器械械 减减少少牵牵拉拉或或挤挤压压组组织织 3 组组织织块块大大小小 一一般般要要小小于于 1mm3 二二 固固定定 固固定定是是指指用用化化学学固固定定剂剂或或一一些些物物理理方方法法迅迅速速杀杀死死细细胞胞 的的过过程程 目目的的是是尽尽可可能能保保持持细细胞胞的的原原有有生生活活状状态态 不不发发生生位位 移移 减减少少组组织织结结构构变变化化 固固定定剂剂的的主主要要作作用用是是使使蛋蛋白白质质 脂脂质质 等等生生物物大大分分子子发发生生某某种种交交联联 1 用用固固定定液液固固定定的的样样品品若若漂漂浮浮在在溶溶液液表表面面 应应通通过过抽抽真真空空的的方方法法 让让样样品品沉沉入入溶溶液液中中 2 使用 使用锇锇酸的注意事酸的注意事项项 I 通通风风橱中的橱中的锇锇酸溶液酸溶液为为 2 的的储备储备液 使用之前需用液 使用之前需用 0 2MPBS 或或 二甲砷酸二甲砷酸盐缓盐缓冲液稀冲液稀释释成成 1 的的锇锇酸溶液 酸溶液 II 锇锇酸酸为剧为剧毒 极易毒 极易挥发挥发的的试剂试剂 必 必须须在通在通风风橱中操作 橱中操作 废废液必液必须须收收 集在密集在密闭闭容器中 第一次使用容器中 第一次使用锇锇酸的同学 酸的同学 请务请务必必获获得老得老师师或其它或其它 熟悉操作人熟悉操作人员员的指的指导导 三 漂洗 三 漂洗 应彻应彻底漂洗干底漂洗干净净 减少固定液与固定液或与脱水 减少固定液与固定液或与脱水剂剂之之间间的的 反反应应 四 脱水 脱水是将四 脱水 脱水是将组织组织中的游离水中的游离水彻彻底清除的底清除的过过程 由于常用的包程 由于常用的包 埋埋剂剂大都是非水溶性大都是非水溶性树树脂 只有将生物脂 只有将生物组织组织中的游离水清除干中的游离水清除干 净净 包埋 包埋剂剂才能浸入才能浸入组织组织 脱水脱水过过程中程中应应注意 注意 I 逐逐级级脱水而不能急脱水而不能急剧剧脱水 脱水 II 更更换换溶液溶液时动时动作要快 特作要快 特别别是不要是不要让组织让组织离开溶液 否离开溶液 否则则会在会在组织组织 内外内外产产生气泡 生气泡 III 脱水脱水过过程中若要程中若要长时间长时间停留或停留或过过夜 夜 应应放在放在 70 脱水脱水剂剂中 并在中 并在 4 保存 保存 五 渗透 渗透就是用包埋五 渗透 渗透就是用包埋剂剂逐逐渐渐取代取代组织组织中的脱水中的脱水剂剂 使 使细细胞内外胞内外 空隙被包埋空隙被包埋剂剂所填充 包埋所填充 包埋剂剂通常由通常由树树脂 硬化脂 硬化剂剂 增塑 增塑剂剂及催及催 化化剂剂 4 种种试剂试剂按一定比例配制而成 按一定比例配制而成 包埋包埋剂剂配制及使用配制及使用过过程中的注意事程中的注意事项项 I 所有容器及玻璃棒等所有容器及玻璃棒等应应是清是清洁洁和干燥的 和干燥的 II 配制配制过过程中程中应搅应搅拌均匀 使用拌均匀 使用过过程中程中应应避免异物 特避免异物 特别别是水 乙醇 是水 乙醇 丙丙酮酮等混入包埋等混入包埋剂剂 III 配制好的包埋配制好的包埋剂应剂应密封保存 避免受潮 剩余包埋密封保存 避免受潮 剩余包埋剂剂可密封并可密封并储储 存在存在 10 20 冰箱中 延冰箱中 延长长其使用期 其使用期 表表 1 戊戊二二醛醛溶溶液液的的配配制制 终浓终浓度度 1 01 52 02 53 04 05 0 0 2M PBS ml50505050505050 25 戊戊二二醛醛水水溶溶液液 ml 46810121620 重蒸水加至重蒸水加至 ml100100100100100100100 表表 2 0 2M 磷酸磷酸缓缓冲液 冲液 PBS 的配制 的配制 按下表比例混合 A B 液后 配成 0 2mol L 的母液 其中其中 pH7 0 为常用配方为常用配方 pH 值5 8 6 0 6 2 6 4 6 6 6 8 7 0 7 2 7 4 7 6 7 8 8 0 A 液8 0 12 3 18 5 26 5 37 5 49 0 61 0 72 0 81 0 87 0 91 5 94 7 B 液92 0 87 7 81 6 73 5 62 5 51 0 39 0 28 0 19 0 13 0 8 50 5 30 在缓冲液中加入葡萄糖 蔗糖或氯化钠等均能改变渗透压 表表 3 多聚甲多聚甲醛醛 戊二戊二醛醛固定液的配制固定液的配制 溶液名称溶液名称 剂剂量量 10 多聚甲多聚甲醛醛溶液溶液 20ml 0 2MPBS 或二砷酸或二砷酸盐缓盐缓冲液冲液 50ml 25 戊戊二二醛醛水水溶溶液液 10ml 重蒸水重蒸水20ml 表表 4 2 锇锇酸溶液的配制酸溶液的配制 试剂试剂 用量用量 A 液 0 2mol L 磷酸氢二钠溶液B 液 0 2mol L 磷酸二氢钠溶液 Na2HPO4 28 4g 或 Na2HPO4 H2O 31 61g 或 Na2HPO4 2H2O 35 6g 或 Na2HPO4 7H2O 53 63g 或 Na2HPO4 12H2O 71 64g 加双蒸水至 1000mL NaH2PO4 24 0g 或 NaH2PO4 H2O 27 6g 或 NaH2PO4 2H2O 31 21g 加双蒸水至 1000mL 锇锇酸酸 g 1 重蒸水重蒸水 ml50 表表 5 Spurr 包埋包埋剂剂配方配方 药药品名称品名称 硬配方硬配方 软软配方配方我我们现们现用的配方用的配方 VCD 树树脂脂 10g10g10g DER7366g7g8g NSA26g26g26g DMAE0 4g0 4g0 4g 注 通注 通过过改改变变 DER736 的用量可以的用量可以调节调节包埋包埋剂剂的硬度 的硬度 DMAE 的用量的用量则调节则调节聚聚 合反合反应应的速度 的速度 透射透射电镜样电镜样品制品制备备程序 程序 No 1 包埋切片包埋切片样样品的制作品的制作过过程程 样样品品在在 2 5 的的戊戊二二醛醛溶溶液液中中 4 固固定定过过夜夜 然然后后按按下下列列步步骤骤处处理理样样品品 倒倒掉掉固固定定液液 用用 0 1M pH7 0 的的磷磷酸酸缓缓冲冲液液漂漂洗洗样样品品三三次次 每每次次 15min 用用 1 的的锇锇酸酸溶溶液液固固定定样样品品 1 2h 倒倒掉掉固固定定液液 用用 0 1M pH7 0 的的磷磷酸酸缓缓冲冲液液漂漂洗洗样样品品三三次次 每每次次 15min 用用梯梯度度浓浓度度 包包括括 50 70 80 90 和和 95 五五种种浓浓度度 的的乙乙醇醇溶溶液液 对对样样品品进进行行脱脱水水处处理理 每每种种浓浓度度处处理理 15min 再再用用 100 的的乙乙醇醇处处理理一一 次次 每每次次 20min 最最后后过过度度到到纯纯丙丙酮酮处处理理 20min 用用包包埋埋剂剂与与丙丙酮酮的的混混合合液液 V V 1 1 处处理理样样品品 1h 用用包包埋埋剂剂与与丙丙酮酮的的混混合合液液 V V 3 1 处处理理样样品品 3h 纯纯包包埋埋剂剂处处理理样样品品过过夜夜 将将经经过过渗渗透透处处理理的的样样品品包包埋埋起起来来 70 加加热热过过夜夜 即即得得到到包包埋埋好好的的样样品品 样样 品品在在 Reichert 超超薄薄切切片片机机中中切切片片 获获得得 70 90nm 的的切切片片 该该切切片片经经柠柠檬檬酸酸 铅铅溶溶液液和和醋醋酸酸双双氧氧铀铀 50 乙乙醇醇饱饱和和溶溶液液各各染染色色 15min 即即可可在在日日本本 JEOL 公公司司的的 JEM 1230 型型透透射射电电镜镜中中观观察察 1 Double fixation The specimen was first fixed with 2 5 glutaraldehyde in phosphate buffer pH7 0 for more than 4hours washed three times in the phosphate buffer once for 15min then postfixed with 1 OsO4 in phosphate buffer pH7 0 for 1hour and washed three times in the phosphate buffer 2 Dehydration The specimen was first dehydrated by a graded series of ethanol 50 70 80 90 95 and 100 for about 15 to 20 minutes at each step transferred to absolute acetone for 20 minutes 3 Infiltration The specimen was placed in 1 1 mixture of absolute acetone and the final Spurr resin mixture for 1hour at room temperature then transferred to 1 3 mixture of absolute acetone and the final resin mixture for 3hours and to final Spurr resin mixture for overnight 4 Embedding and ultrathin sectioning Specimen was placed in capsules contained embedding medium and heated at 70 for about 9hours The specimen sections were stained by uranyl acetate and alkaline lead citrate for 15 minutes respectively and observed in TEM of Model JEM 1230 No 2 负染样品的制作 以细菌为例 Negative staining of bacterium The bacterium suspension was stained by 1 to 2 solution of phosphotungstic acid PTA 磷钨酸 in a pH range of 6 5 to 7 0 for 15 to 30 seconds Then the bacterium was observed in TEM of Model JEM1230 扫描电镜样品制备方法 样品在 2 5 的戊二醛溶液中 4 固定过夜 然后按下列步骤处理样品 倒掉固定液 用 0 1M pH7 0 的磷酸缓冲液漂洗样品三次 每次 15min 用 1 的锇酸溶液固定样品 1 2h 倒掉固定液 用 0 1M pH7 0 的磷酸缓冲液漂洗样品三次 每次 15min 用梯度浓度 包括 50 70 80 90 和 95 五种浓度 的乙醇溶液对样品进行脱水处 理 每种浓度处理 15min 再用 100 的乙醇处理两次 每次 20 min 用乙醇与醋酸异戊酯的混合液 V V 1 1 处理样品 30min 再用纯醋酸异戊酯处理样品 1 2h 临界点干燥 镀膜 观察 处理好的样品在荷兰 Philips 公司的 XL30ESEM 型环境扫描电镜中观察 Spurr 低粘度包埋剂 ERL 4206 2 5g NSA 6 5g DER 736 2 0g DMAE 0 1g 前三种试剂混合均匀后 加入 DMAE 充分混合 按每个样品 2 5g 的用量配制 70 聚合 8h 以上 干脆把透射电镜样品的制备方法一起发了 透射电镜样品制备方法 样品在 2 5 的戊二醛溶液中 4 固定过夜 然后按下列步骤处理样品 倒掉固定液 用 0 1M pH7 0 的磷酸缓冲液漂洗样品三次 每次 15min 用 1 的锇酸溶液固定样品 1 2h 倒掉固定液 用 0 1M pH7 0 的磷酸缓冲液漂洗样品三次 每次 15min 用梯度浓度 包括 50 70 80 90 和 95 五种浓度 的乙醇溶液对样品进行脱水处 理 每种浓度处理 15min 再用 100 的乙醇处理一次 每次 20min 最后过度到纯丙酮处 理 20min 用包埋剂与丙酮的混合液 V V 1 1 处理样品 1h 用包埋剂与丙酮的混合液 V V 3 1 处理样品 3h 纯包埋剂处理样品过夜 将经过渗透处理的样品包埋起来 70 加热过夜 即得到包埋好的样品 样品在 Reichert 超薄切片机中切片 获得 70 90nm 的切片 该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀 50 乙醇 饱和溶液各染色 15min 即可在 JEOL 公司的 JEM 1230 型透射电镜中观察 SEM 需前需前处处理理样样品制品制备过备过程中的程中的注注意意事事项项 I 取材 取材 1cm3左右即可 不需要象左右即可 不需要象 TEM 样样品那么小 品那么小 II 脱水 脱水 样样品品较较大 脱水大 脱水时间时间可适当延可适当延长长 III 临临界点干燥 一般采用液体二氧化碳界点干燥 一般采用液体二氧化碳为为置置换换液 二氧化碳与乙醇或液 二氧化碳与乙醇或 丙丙酮酮互溶性互溶性较较差 而与醋酸异戊差 而与醋酸异戊酯酯互溶液性互溶液性较较好 因此 好 因此 样样品脱水品脱水 后需逐后需逐渐过渐过渡到醋酸异戊渡到醋酸异戊酯酯溶液中浸泡 以便置溶液中浸泡 以便置换换存留于存留于组织组织中中 的脱水的脱水剂剂 注意 醋酸异戊注意 醋酸异戊酯挥发酯挥发性性较强较强 应应在通在通风风橱中操作 橱中操作 废废液用密液用密闭闭容器容器 装好后装好后丢丢弃 弃 IV 金属金属喷镀喷镀 新 新鲜样鲜样品自身就可品自身就可导电导电 而 而经过经过干燥的生物干燥的生物样样品不能品不能 导电导电 这这种不种不导电导电的的样样品在品在 SEM 中中观观察察时时 会 会产产生生电电荷荷积积累而影累而影 响响观观察察稳稳定性 使定性 使样样品品导电导电的方法通常是在的方法通常是在样样品表面品表面喷喷一一层层厚度厚度 约约 100 埃的金膜 埃的金膜 No 1 直直接接观观察察的的扫扫描描电电镜镜样样品品 I 样样品品粘粘附附在在样样品品台台上上 在在 Eiko IB5 型型离离子子溅溅射射仪仪中中喷喷镀镀 4 5min II 样样品品在在荷荷兰兰 Philips 公公司司的的 XL30 型型 ESEM 环环境境扫扫描描电电镜镜 中中观观察察 The specimen was coated with gold palladium in Eiko Model IB5 ion coater for 4 5min and then observed in Philips Model XL30 ESEM No 2 需前需前处处理的理的 SEM 样样品制品制备备程序程序 样样品品在在 2 5 的的戊戊二二醛醛溶溶液液中中 4 固固定定过过夜夜 然然后后按按下下列列步步骤骤处处理理样样品品 倒倒掉掉固固定定液液 用用 0 1M pH7 0 的的磷磷酸酸缓缓冲冲液液漂漂洗洗样样品品三三次次 每每次次 15min 用用 1 的的锇锇酸酸溶溶液液固固定定样样品品 1 2h 倒倒掉掉固固定定液液 用用 0 1M pH7 0 的的磷磷酸酸缓缓冲冲液液漂漂洗洗样样品品三三次次 每每次次 15min 用用梯梯度度浓浓度度 包包括括 50 70 80 90 和和 95 五五种种浓浓度度 的的乙乙醇醇溶溶液液 对对样样品品进进行行脱脱水水处处理理 每每种种浓浓度度处处理理 15min 再再用用 100 的的乙乙醇醇处处理理两两 次次 每每次次 20 min 用用乙乙醇醇与与醋醋酸酸异异戊戊酯酯的的混混合合液液 V V 1 1 处处理理样样品品 30min 再再用用纯纯醋醋酸酸 异异戊戊酯酯处处理理样样品品 1 2h 临临界界点点干干燥燥 镀镀膜膜 观观察察 处处理理好好的的样样品品在在荷荷兰兰 Philips 公公司司的的 XL30 型型环环境境扫扫描描电电镜镜中中观观察察 I Doub