实验十-环境因素对微生物的影g向和紫外诱变效应

课程名称 中学生物实验技术 实验名称 实验十 环境因素对微生物的影 g 向和紫外诱变效应 姓 名 学号 实验成绩 实验日期 年 月 日 实验地点 指导教师 一 实验目的 1 了解物理因素 化学因素及生物因素抑制或杀死微生物的作用及其试验方法 2 了解紫外线诱变原理 并初步掌握紫外线诱变育种的方法 二 实验原理 在自然界中 微生物分布极其广泛 几乎无处不在 微生物的生长发育受着环境因素的影响 而不 同的微生物及微生物不同的生理状态受环境因素影响的程度也不同 有的环境因素是微生物生长繁殖所 必需的条件 有的表现为抑制作用 有的表现为杀菌作用 1 温度对微生物的影响 温度通过影响蛋白质 植酸等生物大分子的结构与功能 以及细胞结构 如细胞膜的流动性及完整性来影响微生物的生长 繁殖和新陈代谢 过高的环境温度会导致蛋白质或核 酸的变性失活 而过低的温度会使酶活力受到抑制 细胞的新陈代谢活动减弱 微生物群体生长 繁殖 最快的温度为其最适生长温度 但它并不等于积累某一代谢产物的最适温度 黏质赛氏杆菌能产生红色 或紫红色色素 菌落表面颜色随着色素量的增加呈现出由橙黄到深红色逐渐加深的变化趋势 2 化学因素对微生物的影响 常用的化学消毒剂主要包括重金属及其盐类 有机溶剂 酚 醇 醛 等 卤族元素及其化合物和表面活性剂等 重金属离子可与菌体蛋白质结合而使之变性或与某些酶蛋白 的巯基相结合而使酶失活 重金属盐则是蛋白质沉淀剂 或与代谢产物发生整合作用而使之变为无效化 合物 有机溶剂可使蛋白质及校酸变性 也可破坏细胞膜透性使内含物外溢 碘可与蛋白质酪氨酸残基 不可逆结合而使蛋白质失活 氧气与水发生反应产生的强氧化剂也具有杀寓作用 染料在低浓度条件下 可抑制细菌生长 染料对细菌的作用具有选择性 革兰阳性菌普遍比革兰阴性菌对染料更加敏感 表面 活性剂能降低溶液表面张力 这类物质作用于微生物细胞膜 改变其进性 同时也能使蛋白质发生变性 3 生物因素对微生物的影响 生物之间的关系从总体上可分为互生 共生 寄生 拮抗等 微生 物之间的拮抗现象是普遍存在于自然界的 许多微生物在其生命活动过程中能产生某种特殊代谢产物如 抗生素 具有选择性地抑制或杀死其他微生物的作用 不同抗生素的抗菌诺是不同的 某些抗生素只对 少数细菌有抗菌作用 例如青霉素一般只对革兰阳性菌具有抗菌作用 多黏菌素只对革兰阴性菌有作用 这类抗生常称为窄谱抗生素 另一些抗生素对多种细菌有作用 例如四环素 土霉素对许多革兰阳性菌 和革兰阴性菌都有作用 称为广谱抗生素 可以通过抗菌谐试验来检测某一种抗生震的抗菌范围 本实 验中主要验证产黄青霉产生的青霉菌和灰色链霉菌产生的链霉素对不同细菌的抑制效果 产黄青霉分泌 青霉素抑制细菌细胞壁的合成 其机理是青霉索与肽聚糖五肽侧链末端 D 丙氨酰 D 丙氨酸结构类 似 青霉素竞争与转肽酶结合形成青霉素转肽酶复合物 从而破坏细胞壁完整网状结构 青霉素对革兰 阳性菌的作用强于革兰阴性菌 链霉素作用于核糖核酸 30S 亚基 由于真核生物是 80S 60S 40S 原核 生物是 70S 30S 50S 所以链霉素只作用原核生物 4 紫外线对微生物的影响及诱变效应 1 紫外线具有杀菌作用 主要是因为它诱导形成胸腺嘧啶二聚体来破坏 DNA 的结构 使其不能正 常行使功能 另外 空气在紫外线照射下产生臭氧 O3 也有一定杀菌作用 紫外线杀菌力最强的波长 是 226 256nm 部分 紫外线灭菌一般是用紫外灯管实现的 紫外线透过物质能力很差 所以只适用于空 气及物体表面的灭菌 它距离照射物以不超过 1 2m 为宜 紫外线对于人体也有伤害作用 所以不能直 视开着的紫外灯 更不能在开着紫外灯的情况下工作 可见光能激活生物体中的光复活酶 使形成的二 聚体拆开复原 部分或全部消除紫外线的作用 所以也不能同时开着钨丝灯及日光灯情况下开紫外灯灭 菌 且经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射 需用双层报纸包裹后培养 2 紫外线对细菌生长的影响 此影响是随着紫外线对微生物照射剂量 时间及距离的不同 对微生 物的生理活动也相应地产生不同的效果 剂量高 时间长 距离短就易杀死它们 剂量怔 时间短 距 离长时就会有少量个体残存下来 其中一些个体的遗传特性发生了变异 我们可以利用这种特性来进行 灭菌或菌种选育工作 紫外诱变最有效的波长仅仅是在 253 265nm 一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线 大约有 80 是 254nm 紫外线诱变的主要生物学效应是由于 DNA 变化而造成的 DNA 对紫外线有强 烈的吸收作用 尤其是碱基中的嘧啶 它比嘌呤更为敏感 紫外线引起 DNA 结构变化的形式很多 如 DNA 链的断裂 碱基破坏 但其最主要的作用是使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体 阻碍 碱基间的正常配对 从而引起微生物突变 三 实验材料 1 紫外照射箱 37 培养箱 25 培养箱 200 l 1ml 5ml 取液器 相应的灭菌枪头 2 20 个无菌平板 内含 20ml 左右固体培养基 l0ml 无菌带帽试管 或 Eppendorf 管 每组 10 支 无 菌涂棒 无菌的小圆滤纸片 接种环 黑纸 标签纸 酒精灯 记号笔 试管架 3 金黄色葡萄球菌液 Staphyloccus aureus 大肠杆菌 Escherichia coli 黏质赛氏杆菌 Serratia marcescens 枯草杆菌 Bacillus subtilis 的试管斜面 在一边已长成一直线状菌落的产黄青霉 灰色链霉 菌平板各 1 个 4 肉汤蛋白胨琼脂培养基 淀粉培养基 5 2 5 碘酊 75 乙醇 5 苯酚 1 200 稀释的 84 消毒液 1 500 甲醛溶液 0 05 甲紫 四 实验步骤 一 化学因素对微生物生长的影响 1 用无菌吸头吸取 200 l 培养了 18h 的金黄色葡萄球菌菌液于肉涵蛋白胨培养基上 用无菌涂布 棒涂布均匀 放置片刻 等菌液全部被培养基吸收后进行下一步实验 2 将上述培养皿用记号笔分成数等份 每一等份内标明一种药物名称 3 用无菌镊子将小滤纸片分别浸入各种药剂中 取出 并在试管内壁上除去多余药液后 以无菌 择作将纸片对号放人培养皿的小区内 注窟每种药剂专用一把镊子 防止不同药剂互相污染 4 置 37 培养箱培养 48h 后观察结果 比较抑菌圈大小 二 生物因素对微生物生长的影响 选做 1 用肉汤蛋白胨培养基制成平板 在平板一侧 用接种环取产黄青霉的孢子 在平扳上划一直线 接种 置于 28 培养 48 72h 2 待形成菌苔后 从距产黄毒霉的菌苔边缘 5mm 处用接种环并分别垂直向外划直 线接种已培 养 18h 的大肠杆菌 枯草杆菌和金黄色葡萄球菌 在 37 培养箱中培养 48h 观察结果 用同样的方法做灰色链霉菌的抗菌性试验 三 紫外线杀菌效果的观察 用无菌吸头吸取 l00ml 培养了 18h 的金黄色葡萄球菌液于肉汤蛋白胨培养基平板上 以无菌涂棒涂 布均匀 用一张三角形锡纸条 或其他形状的纸条 遮住部分平板 打开皿盖 置紫外灯下照射 3rain 后取 出锡纸 或纸条 盖上皿盖 在黑暗中 或红灯下 用双层报纸包裹 倒置于 37 培养箱中培养 48h 后观 察结果 四 紫外线对微生物的诱变效应 1 菌液的制备 把枯草杆菌菌种接人有 l00ml 培养基的 250ml 无菌三角瓶中 37 200r min 摇 床培养 18h 2 稀释 取摇瓶培养至对敷生长期的菌液 菌液浓度为 108 1010 m1 0 5ml 入 4 5ml 生理盐水中或 0 1ml 入 4 9ml 生理盐水中 进行 10 倍稀释 稀释度为 l0 1一 10 8 3 涂布 取 10 1 10 8的菌液各 100 1 涂平板 每个稀释度涂平板 2 块 4 紫外线处理 分别对 10 6 10 1的平板照射 10s 20s 30s 40s 50s 60s 紫外灯功率为 30W 照射距离为 30cm 以 10 7和 l0 8平板作对照 处理的培养皿在黑暗中 或红灯下 用双层报纸包好 倒置 37 C 培养 48h 后观察并记录结果 5 观察诱变效应 将培养皿取出 分别向菌落分散开的平板内加卢戈碘液 或革氏碘液 数滴 在菌 落周围将出现透明圈 分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值 HC 值 与对照平板进行比较 把 明显大于对照的菌落接到斜面培养保存 五 实验结果与讨论 1 观察化学试剂的抑菌现象 测量抑菌圈半径 如表 10 1 表 10 1 化学试剂的抑菌现象 化学试剂抑菌圈半径 mm 抑菌能力排序 2 5 碘酊31 75 乙醇1 26 5 苯酚3 22 1 200 稀释的 84 消毒液23 1 500 甲醛溶液1 84 0 05 甲紫1 55 2 记录紫外线对各浓度枯草杆菌的诱变情况 填入表 10 2 并测定透明圈直径与菌落直径的比值 表 10 2 紫外线对各浓度枯草杆菌的诱变情况 处理后活菌数稀释度照射时间 s