流式讲座

,流式细胞术临床应用概 述,2016年4月,主要内容,流式细胞术简介流式细胞术临床应用概述,何为流式？,流式细胞术（简称流式）flow cytometry，FCM 概括来说：流式就是对快速、直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。,流式的发展,1934 年，Moldavan首次提出“流式细胞术” 的概念。 1949 年，Wallace Coulter 提出悬液中计数粒子的方法并获得专利； 1953 年，Parker和 Horst描述一种全血细胞计数器，成为FCM的雏形； 1959 年，B型 Coulter计数器问世（库尔特电子血球计数器 ）；1969 年，Van Dilla，Fulwyler 及其同事们发明第一台荧光检测细胞计；1972 年，Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经荧 光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号，流式进入“荧光染色时代”。1973年，BD与斯坦福大学合作开发的第一台商用流式细胞仪FACS I 问世。1975 年，Kochler和 Milstein 提出了单克隆抗体技术，为细胞研究中大量的特异的免疫试剂的应用奠定了基础。,流式细胞仪与血球仪,流式细胞仪&血球仪本是同根生，发展各不同,流式检测系统,（1）流动室和液流系统；（2）激光源和光学系统；（3）光电管和检测系统；（4）计算机分析系统 ；（5）分选系统,流式检测范围,细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量,细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内/外的细胞因子激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化pH值钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位 ,流式之魅力,1、系统开放灵活：（1）检测对象多样：细胞、微生物、人工微球。（2）检测范围广：细胞结构、细胞功能（3）研究方案多样：多种抗体、染料，组合不拘一格。2、运行高效准确：千个/秒的分析速度。3、可识别多参数：可同时分析单个细胞的多种特征，使细胞亚群的识别、计数更为准确。4、定性与定量分析：如CD4+T细胞的绝对计数。 5、强大的分选功能：在分析的同时可以对特定群体加以分选。,主要内容,流式细胞术简介流式细胞术临床应用概述,流式细胞术临床应用概述,免疫 淋巴细胞亚群分析 HLA-B27检测 移植后免疫状态监测 造血干细胞计数,血液 白血病的免疫分型 微小残留检测 网织红细胞计数 阵发性血红蛋白尿(PNH) 血小板功能及相关疾病,肿瘤 肿瘤的细胞周期和倍体分析 肿瘤相关基因表达的研究,之免疫学,流式细胞术的临床应用,流式细胞术的临床应用,1、免疫系统概述2、淋巴细胞亚群分析3、HLA-B27检测,识别 抗原的特征及免疫系统对抗原的识别 反应 受体和配体间的信号传导和抗原应答 调节 受体、效应细胞(分子)、调节细胞(分子) 在免疫应答正向和负向调节中的作用 记忆 记忆性T细胞、B细胞的免疫记忆,四大能力,免疫系统,免疫细胞,先天免疫中性粒细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞单核 / 巨噬细胞树突状细胞NK 细胞NKT细胞 T 淋巴细胞 CD5+ B细胞,获得性免疫B细胞辅助性T细胞（CD4+）Th1Th2细胞毒T细胞（CD8+）调节性T细胞,Shi FD et al. Trends Immunol 2001,免疫细胞,免疫细胞分化图,流式细胞术的临床应用,1、免疫系统概述2、淋巴细胞亚群分析3、HLA-B27检测,18,外周血标本 红细胞裂解液处理后,淋巴细胞,单核细胞,粒细胞,NK细胞(CD3-/CD16+56+),B淋巴细胞(CD3-/CD19+),T淋巴细胞(CD3+),辅助性/诱导性T细胞 Th/Ti(CD3+/CD4+),抑制性/杀伤性T细胞 Ts/Tc(CD3+/CD8+),淋巴细胞亚群分类,淋巴细胞亚群分类,先天免疫(无抗原特异性，无记忆性),获得性免疫(抗原特异性，可有记忆性),NK,T,B,T8,CD3-CD56+,CD3+CD8+,T4,Treg,TH1,FoxP3+CD25+CD127+/-,TH17,PC,IFNIL-2TNF,IL-4IL-6IL-10,IL17,CD38+CD138+,memB,CD27+IgM+ (-),CD3+CD4+,CD3+,CD19+,TH2,淋巴细胞亚群功能,T淋巴细胞可以直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，是身体中为抵御疾病感染、肿瘤而形成的英勇斗士。B淋巴细胞是体内专职产生抗体、执行体液免疫功能以清除游离感染病原微生物的淋巴细胞。NK细胞则是体内的非特异性免疫细胞，病原微生物感染机体，主要是NK细胞在第一时间参与感染免疫应答，清除外来病原体。,CD4+细胞 增高：提示体内存在细菌感染，主要见于临床各种细菌性感染性疾病。 降低：提示机体存在病毒感染，以HIV感染时减少最为明显，也可见于肿瘤、应用免疫抑制剂、胸腺发育不良、严重联合免疫缺陷病、严重创伤、大手术等。CD8+细胞 增高：提示体内存在病毒或胞内寄生菌感染，例如：HBV、CMV、EB等病毒、结核杆菌等。 降低：CD8+ 细胞减少见于胸腺发育不良、严重联合免疫缺陷病、糖尿病等。,不同抗原表达的意义 -CD4+、CD8+,CD4+/CD8+比值倒置，以全身性、侵袭和破坏机体免疫系统的感染引起的倒置变化幅度最大。抗感染治疗有效时，可以观察CD4+/CD8+细胞比值的逐步恢复。器官移植受者为防止移植排斥发生，需要长期口服免疫抑制剂类药物，但是如果免疫功能抑制过度，极容易发生感染等副反应。为此，需要经常性监测受者的免疫功能， CD4+/CD8+细胞比值是非常好的一个监测指标。当受者CD4+/CD8+细胞比值小于0.2的情况时，必须立即停用免疫抑制药，等待免疫功能的适当恢复。,CD4+/CD8+比值,不同抗原表达的意义 -CD4+/CD8+,B细胞（CD3-CD19+）减少：见于原发及继发性免疫功能低下，临床可出现反复发作的呼吸道及消化道感染；还可见于临床严重病毒感染、使用免疫抑制药等情况。增高：提示机体体液免疫功能被增强，此时体内高亲和力抗体的产生也增加，见于临床各种细菌性感染；也见于B细胞白血病、淋巴瘤。,不同抗原表达的意义 -B Cell,NK细胞CD16+56+1. 与肿瘤性疾病的发生、发展和转归密切相关。一般而言，肿瘤患者NK细胞数量较正常人减少，且减少的程度与肿瘤病情的严重程度密切相关；病情好转，NK细胞数量回升。因此，NK细胞数量是肿瘤病情判断、疗效监测的指标。2. NK细胞是机体抗某些病毒、细菌、寄生虫、真菌感染的重要免疫因素，NK细胞异常在病毒感染时异尤其突出。NK细胞减少见于萨科奇病毒、脑心肌炎病毒、流感病毒、EB病毒、HSV-型等感染。3. 参与型超敏反应和移植物抗宿主反应，IL-2治疗后外周血NK细胞数量增加。,不同抗原表达的意义-NK,淋巴细胞亚群分析的临床意义,（一）先天免疫缺陷（二）感染性疾病（三）AIDS,淋巴细胞亚群分析与先天免疫缺陷,淋巴细胞亚群分析的临床意义(一),免疫缺陷病的概念：,免疫缺陷病是一种由于人体的免疫系统发育缺陷或免疫反应障碍致使人体抗感染能力低下，临床的表现是反复感染或严重感染。 按发病原因可分为先天遗传性免疫缺陷病（原发性）和后天继发性免疫缺陷病两大类，它们均会因免疫功能低下或缺失而容易发生严重感染或肿瘤。,原发性免疫缺陷病发病率,以活产婴计算：1/10000 （1981年日本和1983年澳洲的报道，目前认为是1/5000）香港报道：1/8000（1997年报道）目前我国大陆尚无统计学报道按1/10000人发病率，我国每年新出生的2500万新生儿中应有2500个，整个儿童期的累计患者应有36万例以上。,原发性免疫缺陷病分类,T细胞和B细胞联合免疫缺陷（24种）主要抗体缺陷（16种）其它已明确的免疫缺陷综合症（14种）免疫失调性疾病（15种）吞噬细胞数目、功能先天性缺陷（26种）天然免疫缺陷（7种）自身炎症性疾病（6种）补体缺陷（23种）,原发性免疫缺陷病预警症状,症状婴儿体重不增，生长发育停滞缺乏淋巴结或扁桃体皮肤病变：毛细血管扩张、出血点、皮肤霉菌、红斑性狼疮样皮疹共济失调一岁以上出现的鹅口疮口腔溃疡,原发性免疫缺陷病预警症状,病史一年中有8次以上中耳炎一年中有2次以上严重鼻窦炎一年中有2次以上肺炎在非常见部位发生深部感染2次以上反复发生深部皮肤或脏器感染（如脑膜炎、骨髓炎、蜂窝织炎、败血症等）需要静注抗生素才能清除感染非常见或条件性致病菌感染家庭有原发性免疫缺陷病（PID）病史者,“卡介苗”噩梦,患儿男, 5个半月,以“发热、腹泻11天,皮疹7天”为主诉入院。 诊断为: (1)腹泻病; (2)发热待查:结缔组织病?(3)营养不良性贫血。 入院后给予抗感染、补液,调整肠道微生态,营养支持治疗,腹泻治愈,仍发热,皮疹渐增多,蔓延至上腹部、胸前,皮疹呈棕色或棕黑色。入院第12天对患儿左大腿内侧一皮疹下结节进行活检见:表皮角化,真皮脂肪坏死,炎性细胞浸润,考虑脂膜炎。但疗效不显。体液免疫检查正常; T细胞亚群: CD3+ 2.41%(56%84% ), CD4+ 0.53% (27%51% ), CD8+ 0.50% (15%44% ), CD4+/CD8+ 1.06。追问病史:此患儿生后接种卡介苗部位常有渗液,不久结痂,结痂后不久又出现渗液,如此反复。遂对既往骨髓片及组织片进行抗酸染色,均见大量抗酸杆菌。确诊为原发性T细胞免疫缺陷病合并卡介苗接种后播散性结核病、结核性结节性脂膜炎。后因经济困难家长要求出院随访结果出院2 d后死亡。,淋巴细胞亚群分析的临床意义病例1,淋巴细胞亚群分析与感染性疾病,淋巴细胞亚群分析的临床意义(二),细菌感染？病毒感染？,淋巴细胞亚群分析的临床意义病例2,感染？污染？,淋巴细胞亚群分析的临床意义病例2,淋巴细胞亚群分析的临床意义病例2,淋巴细胞亚群分析的临床意义病例3,33岁男性，2016-01-06，以“低热半月”主诉入院。入院检查：淋巴细胞亚群CD4/CD80.21，衣原体抗体阳性，人巨细胞病毒阳性，考虑患者免疫功能极度下降后继发巨细胞病毒感染，更昔洛韦抗病毒治疗后好转出院。,提示：体液免疫下降、 CD4/CD8比值倒置，典型的病毒感染表现,淋巴细胞亚群分析的临床意义病例4,男，82岁，主诉“咳嗽、咳痰、胸闷憋气3天，加重伴神志模糊1天” 于2016年1月10日入院，5年前患食道癌，行放化疗治疗。住院情况：患者病情危重，于2016-1-13转入ICU，经抗感染及对症治疗后，2016-1-21拔除气管插管，转出ICU，后因拒绝继续治疗，要求出院。 出院诊断:1、肺部感染2、休克（低血容量性、感染性）3、呼吸衰竭4、电解质紊乱低钠血症6、食管癌,提示：T细胞免疫力极度低下,淋巴细胞亚群分析与AIDS,淋巴细胞亚群分析的临床意义（三）,艾滋病（ADIS）主要是由于HIV病毒感染后，特异性地攻击CD4+的T细胞，使人体丧失免疫功能，易于感染各种疾病，并可发生恶性肿瘤，病死率较高。,艾滋病(AIDS),艾滋病(AIDS),AIDS与流式,HIV的检测是AIDS诊断的金指标。流式报告CD4+T细胞百分含量、绝对计数减少是AIDS最重要的辅助诊断指标。对于一个同时有HIV初筛实验室和流式细胞室的医院，在AIDS筛查的实验室诊断中，流式结果往往早于HIV的免疫学和病毒学检测结果、对患者疾病状态的解释，具有最直接的指导意义。问题：如果看待一份HIV初筛阳性（+）但确证试验阴性/可疑的检测报告？,男，47岁，主诉“胸闷、发热3个月，发热加重2天 ”于2015年10月入院。影像学检查：胸部CT见双肺内弥漫分布的淡薄磨玻璃影，诊断为重症肺炎 。 实验室检查:HIV3次初筛阳性、CDC的HIV确证试验“HIV抗体不确定”。,提示：CD4/CD8比值极度低下，典型HIV感染表现，CD4+绝对计数结果不详,淋巴细胞亚群分析的临床意义病例5,淋巴细胞亚群分析的临床意义,是因？ 是果？病例1：原发性免疫缺陷 病例2：细菌感染病例4：ICU食管癌患者 病例3：病毒感染病例5：AIDS,思考,一份流式报告单,淋巴细胞亚群分析的临床意义,淋巴细胞亚群分析的临床意义,是因，可以解释疾病的根源所在,是果，可以进一步帮助明确诊断,应认识到：因、果有时会同时存在,动态监测有助于掌握病情走势(病例6),一份异常的淋巴细胞亚群流式报告单,淋巴细胞亚群分析的临床意义病例6,年龄:73岁，性别:男既往：2011年发现“小B细胞淋巴瘤”，化疗6个周期，此后定期复查，自述病情无进展。1、2014年7月，以“咳嗽、咳痰1月，发热10余天”第1次入院，后明确诊断为“右下肺细支气管肺泡癌b期，左侧结核性胸膜炎”，给予PC方案化疗、抗结核治疗。2、2014年8月，第2次住院，继续化疗和抗结核治疗,病情稳定。3、2014年12月，第3次入院，给予辅助抗肿瘤、抗结核、保肝等对症治疗，出院后抗结核治疗11月复查病情稳定停药。出院3月后，复查胸部CT示右肺病灶较前增大，双肺转移灶增多。4、2015年10月，第4次入院，行骨髓穿刺示淋巴细胞增生活跃，占79.5%，不排除骨髓瘤复发，行CT引导下肺穿刺送检涂片查见腺癌细胞，明确肺内病变系肺癌进展所致，但患者家属拒绝应用全身化疗，于2015年10月30日开始口服凯美钠靶向治疗，2016年1月7日因无药而自行停药。5、2016-01-11，第5次入院，骨髓穿刺术，考虑为淋巴瘤复发。,5次住院淋巴细胞亚群的变化病例6,提示：细胞免疫功能下降、淋巴瘤复发、肺癌进展,5次住院淋巴细胞亚群的变化病例6,提示：细胞免疫功能下降、淋巴瘤复发、肺癌进展,淋巴细胞亚群在肿瘤诊疗中的应用,淋巴细胞亚群在自身免疫性疾病中的应用,淋巴细胞亚群在成人呼吸疾病中的应用,T 淋巴细胞亚群在BALF的不同表现,淋巴细胞亚群在儿科中的应用,淋巴细胞亚群在消化系统疾病中的应用,淋巴细胞亚群在泌尿系统疾病中的应用,淋巴细胞亚群在内分泌系统疾病中的应用,淋巴细胞亚群在皮肤疾病中的应用-1,淋巴细胞亚群在皮肤疾病中的应用-2,总结：淋巴细胞亚群临床应用之体会,虽然通过流式检测淋巴细胞亚群的结果并不是某种疾病特异的，但是这些以CD为基础的亚群分型指标，却可以比较准确、全面地评估患者的免疫状态，为临床疾病的诊断、症状解释、治疗、病情监测提供了量化的免疫状态指标，而这是任何其他实验室诊断技术都无法做到的。,流式细胞术的临床应用,1、免疫系统概述2、淋巴细胞亚群分析3、HLA-B27检测,强制性脊柱炎与HLA-B27,强直性脊柱炎概述强直性脊柱炎与HLA-B27相关性强直性脊柱炎的鉴别诊断流式细胞术检测HLA-B27,强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis, AS）是脊柱及其附属组织的慢性进行性炎性疾病，属于脊柱关节病的一种亚型，主要累及骶髂关节、脊柱关节、椎旁软组织及四肢关节。,AS呈高度遗传性，青壮年为主要高发人群，发病年龄通常低于30岁(常见1331岁)，男性多于女性。 AS早期发病隐匿，症状多变，极易被误诊或漏诊，故应争取早期诊断，早期治疗 。 我国AS患者的发病率为3，按13亿人口推算，大约有400余万人。由于中早期强直性脊柱炎确诊率比较低，实际发病率应该不止400万人。,强直性脊柱炎概述,强直性脊柱炎,强直性脊柱炎早期以慢性双侧骶髂关节炎为特征；晚期骨突关节融合，韧带赘形成，脊柱韧带钙化，导致脊柱从颈到骶骨完全强直。早期诊断有助于早期治疗，防止致残。,主 要 内 容,强直性脊柱炎概述强直性脊柱炎与HLA-B27相关性强直性脊柱炎的鉴别诊断流式细胞术检测HLA-B27,HLA-B27 概述,HLA即人类白细胞抗原(Human Leucocyte Antigen)的简称，分属于A、B、C、D和DR 5个位点，HLA-B位点有42个等位基因，B27即为其中之一HLA-B27主要表达在机体中所有有核的细胞上，尤其是淋巴细胞的表面有丰富的含量 。主要生理功能是携带递呈的细菌多肽，激活CD8+ T淋巴细胞，从而导致脊椎关节病。,早在1973年，Schosstein就已经发现强直性脊椎炎（ankylosing spondylitis, AS）的发病与人群中HLA-B27的表达频率有关，许多证据均表明B27 直接参与了AS的发病，二者呈高度相关性，AS患者中HLA-B27阳性率高达90以上。许多研究均证实，AS病人HLA-B27阳性率高于正常人群，可达90%96%，而普通人群HLA-B27阳性率仅2%7%。HLA-B27阳性将显著增加正确诊断AS的机会，阴性则排除AS的可能性增加，为临床诊断和鉴别诊断提供了有力的支持。,* Lee Schlosstein, High Association of an HL-A Antigen, W27, with Ankylosing Spondylitis, N Engl J Med 1973; 288:704-706,强直性脊柱炎与HLA-B27相关性,主要内容,强直性脊柱炎概述强直性脊柱炎与HLA-B27相关性强直性脊柱炎的鉴别诊断流式细胞术检测HLA-B27,类风湿关节炎（RA）,AS以HLA-B27阳性居多，而RA则与HLA-DR4相关。AS在男性多发而RA女性居多AS无一例外有骶髂关节受累，RA则很少有骶髂关节病变 AS为全脊柱自下而上地受累，RA只侵犯颈椎外周关节炎在AS为少数关节、非对称性，且以下肢关节为主；在RA则为多关节、对称性和四肢大小关节均可发病AS无RA可见的类风湿结节AS的RF阴性，而RA的阳性率占60%95%AS与RA发生在同一患者的机遇为1/10万20万。,主要内容,强直性脊柱炎概述强直性脊柱炎与HLA-B27相关性强直性脊柱炎的鉴别诊断流式细胞术检测HLA-B27,HLA-B27检测,HLA-B27阴性样本,HLA-B27阳性样本,之血液学,流式细胞术的临床应用,流式细胞仪的应用（血液）,白血病和淋巴瘤免疫分型残留白血病造血干细胞计数PNH诊断网织红细胞分析血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表达血小板活化网织血小板分析血小板抗体,白血病免疫分型,定义：白血病免疫分型是利用单克隆抗体（McAb）检测白血病细胞的细胞膜和细胞浆抗原，分析其表型，以了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。WHO MICM分型标准 Morphology形态学Immunology免疫学Cytogenetics细胞遗传学Molecular Biology 分子生物学,免疫分型常用的抗体,AMLCD34、CD117、CD33、CD13、HLA-DR、CD11