湖北省枝江五中2012高考生物二轮资料 第4部分 生物技术实践 基础知识梳理

用心 爱心 专心1 湖北省枝江五中湖北省枝江五中 20122012 高考生物二轮资料 第高考生物二轮资料 第 4 4 部分部分 生物技术实践生物技术实践 基础知识梳理基础知识梳理 基础知识梳理基础知识梳理 课题课题课题课题 1 1 1 1 果酒和果醋的制作果酒和果醋的制作果酒和果醋的制作果酒和果醋的制作 一 实验原理一 实验原理 1 酵母菌的细胞呼吸 酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖 表达式为 C6H12O6 O2CO2 H2O 能量 酶 酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳 表达式为 C6H12O6C2H5OH CO2 能量 酶 2 酵母菌发酵的最佳环境 酵母菌在有氧和无氧的条件下都能生活 在有氧时 酵母菌大量繁殖 但是不起到发 酵效果 在无氧时 繁殖速度减慢 但是此时可以进行发酵 在利用酵母菌发酵时最好是 先通入足够的无菌空气在有氧环境下一段时间使其繁殖 再隔绝氧气进行发酵 20 左右 最适合酵母菌繁殖 酒精发酵的最佳温度是在 18 25 pH 最好是弱酸性 3 醋酸菌好氧性细菌 当缺少糖源时和有氧条件下 可将乙醇 酒精 氧化成醋酸 表达式为 C2H5OHCH3COOH H2O 当氧气 糖源都充足时 醋酸菌将葡萄汁中的糖分 酶 解成醋酸 醋酸菌生长的最佳温度是在 30 35 二 实验步骤二 实验步骤 1 对发酵瓶 纱布 榨汁机 盛葡萄汁的器皿等实验用具进行清洗并消毒 先用温水 反复冲洗几次 再用体积分数为 75 的酒精擦拭消毒 晾干待用 2 取葡萄 500 g 去除枝梗和腐烂的子粒 3 用清水冲洗葡萄 1 2 遍除去污物 注意不要反复多次冲洗 4 用榨汁机榨取葡萄汁后 将其装入发酵瓶中或将葡萄打成浆后 用洁净的纱布过滤 至发酵瓶中 盖好瓶盖 如果没有合适的发酵装置 可以用 500 mL 的塑料瓶替代 但注入 的果汁量不要超过塑料瓶总体积的 2 3 5 将发酵瓶置于适宜的温度下发酵 6 由于发酵旺盛期 CO2的产量非常大 因此需要及时排气 防止发酵瓶爆裂 如果使 用简易的发酵装置 如瓶子 最好选用塑料瓶 每天要拧松瓶盖 2 4 次 进行排气 7 10 d 以后 可以开始进行取样检验工作 例如 可以检验酒味 酒精的含量 进 行酵母菌的镜检等工作 8 当果酒制成以后 可以在发酵液中加入醋酸菌或醋曲 然后将装置转移至 30 35 的条件下发酵 适时向发酵液中充气 如果找不到醋酸菌菌种或醋曲 可尝试自然接种 但效果不是很好 如果没有充气装置 可以将瓶盖打开 在瓶口盖上纱布 以减少空气中 尘土等的污染 三 注意事项三 注意事项 请分析此装置中的充气口 排气口和出料口分别有哪些作用 为什么排气口要通过一 个长而弯曲的胶管与瓶身连接 结合果酒 果醋的制作原理 你认为应该如何使用这个发 酵装置 用心 爱心 专心2 充气口 排气口 出料口 答 充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的 排气口是在酒精发酵时用来排 出 CO2的 出料口是用来取样的 排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接 其目的 是防止空气中微生物的污染 使用该装置制酒时 应该关闭充气口 制醋时 应将充气口 连接气泵 输入氧气 课题课题 2 2 腐乳的制作腐乳的制作 一 实验原理一 实验原理 1 参与豆腐发酵的微生物有青霉 酵母 曲霉 毛霉等多种 其中起主要作用的是毛 霉 2 毛霉是一种丝状真菌 常见于土壤 水果 蔬菜 谷物上 具有发达的白色菌丝 3 毛酶等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸 脂肪 酶可将脂肪分解成甘油和脂肪酸 二 实验步骤二 实验步骤 1 将豆腐切成 3cm 3cm 1cm 的若干块 所用豆腐的含水量为 70 左右 水分过多 则腐乳不易成形 2 将豆腐块平放在铺有干粽叶的盘内 粽叶可以提供菌种 并能起到保温的作用 每 块豆腐等距离排放 周围留有一定的空隙 豆腐上面再铺上干净的粽叶 气候干燥时 将 平盘用保鲜膜包裹 但不要封严 以免湿度太高 不利于毛霉的生长 3 将平盘放入温度保持在 15 18 的地方 毛霉逐渐生长 大约 5 d 后豆腐表面丛 生着直立菌丝 4 当毛霉生长旺盛 并呈淡黄色时 去除包裹平盘的保鲜膜以及铺在上面的粽叶 使 豆腐块的热量和水分能够迅速散失 同时散去霉味 这一过程一般持续 36 h 以上 5 当豆腐凉透后 将豆腐间连接在一起的菌丝拉断 并整齐排列在容器内 准备腌制 6 长满毛霉的豆腐块 以下称毛坯 与盐的质量分数比为 5 1 将培养毛坯时靠近 平盘没长直立菌丝的一面统一朝向玻璃瓶边 将毛坯分层盘立摆放在容器中 分层加盐 并随层加高而增加盐量 在瓶口表面铺盐厚些 以防止杂菌从瓶口进入 约腌制 8 d 注 用盐腌制时 注意盐都用量 盐的浓度过低 不足以抑制微生物生长 可能导致 豆腐腐败变质 盐的浓度过高 会影响腐乳的口味 7 将黄酒 米酒和糖 按口味不同而配以各种香辛料 如胡椒 花椒 八角茴香 桂 皮 姜 辣椒等 混合制成卤汤 卤汤酒精含量控制在 12 左右为宜 注 酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系 酒精含量越高 对蛋白 酶的抑制作用也越大 使腐乳成熟期延长 酒精含量过低 蛋白酶的活性高 加快蛋白质 的水解 杂菌繁殖快 豆腐易腐败 难以成块 8 将广口玻璃瓶刷干净后 用高压锅在 100 蒸汽灭菌 30 min 将腐乳咸坯摆入瓶 中 加入卤汤和辅料后 将瓶口用酒精灯加热灭菌 用胶条密封 在常温情况下 一般六 个月可以成熟 三 注意事项三 注意事项 1 酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵 前期发酵所发生的主 要变化是毛霉在豆腐 白坯 上的生长 发酵的温度为 15 18 此温度不适于细菌 用心 爱心 专心3 酵母菌和曲霉的生长 而适于毛霉慢慢生长 毛霉生长大约 5 d 后使白坯变成毛坯 前期 发酵的作用 一是使豆腐表面有一层菌膜包住 形成腐乳的 体 二是毛霉分泌以蛋白酶 为主的各种酶 有利于豆腐所含有的蛋白质水解为各种氨基酸 后期发酵主要是酶与微生 物协同参与生化反应的过程 通过腌制并配入各种辅料 红曲 面曲 酒酿 使蛋白酶作 用缓慢 促进其他生化反应 生成腐乳的香气 2 毛霉是一种低等丝状真菌 有多个细胞核 进行无性繁殖 毛霉是食品加工业中的 重要微生物 它可以产生能够分解大豆蛋白的蛋白酶 常用于制作腐乳和豆豉 课题课题 3 3 探讨加酶洗衣粉的洗剂效果探讨加酶洗衣粉的洗剂效果 一 实验原理一 实验原理 1 加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉 目前常用的酶制剂有四类 蛋白酶 脂肪酶 淀粉酶和纤维素酶 其中 应用最广泛 效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶 2 碱性蛋白酶能将血渍 奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子 的肽 使污迹从衣物上脱落 脂肪酶 淀粉酶和纤维素酶也能分别将大分子的脂肪 淀粉 和纤维素水解为小分子物质 使洗衣粉具有更好的去污能力 3 在本课题中 我们主要探究有关加酶洗衣粉的三个问题 一是普通洗衣粉和加酶洗 衣粉对衣物污渍的洗涤效果有什么不同 二是在什么温度下使用加酶洗衣粉效果最好 三 是添加不同种类的酶的的洗衣粉 其洗剂效果有哪些区别 二 实验步骤二 实验步骤 1 探究用加酶洗衣粉与普通洗衣粉洗涤的效果的不同 在 2 个编号的烧杯里 分别注入 500mL 清水 取 2 块大小相等的白棉布 用滴管在每块白布上分别滴上等量的墨水 分别放入烧 杯里 用玻璃棒搅拌 将 2 个烧杯分别放入同等温度的温水中 保温 5 分钟 称取 5 克加酶洗衣粉和 5 克普通洗衣粉 2 份 分别放入 2 个烧杯中 用玻璃棒均匀 搅拌 保温 10 分钟 观察并记录 2 个烧杯中的洗涤效果 2 探究用加酶洗衣粉洗涤的最佳温度条件 在 3 个编号的烧杯里 分别注入 500mL 清水 取 3 块大小相等的白棉布 用滴管在每块白布上分别滴上一滴食用油 鸡血 牛奶 分别放入烧杯里 用玻璃棒搅拌 将 3 个烧杯分别放入 50 摄氏度的热水 沸水和冰块中 保温 5 分钟 称取 5 克加酶洗衣粉 3 份 分别放入 3 个烧杯中 用玻璃棒均匀搅拌 保温 10 分钟 观察并记录 3 个烧杯中的洗涤效果 3 探究不同种类的加酶洗衣粉洗涤的效果 污染物蛋白酶洗衣粉脂肪酶洗衣粉复合酶洗衣粉普通洗衣粉 油渍 汗渍 血渍 观察并记录四种洗衣粉分别洗涤三种污染的洗涤效果 三 注意事项三 注意事项 用心 爱心 专心4 1 变量的分析和控制 影响加酶洗衣粉洗涤效果的因素有水温 水量 水质 洗衣粉的用量 衣物的质料 大小及浸泡时间和洗涤的时间等 在这些因素中 水温是我们要研究的对象 而其他因素 应在实验中保持不变 选择什么样的水温进行实验需要实验者根据当地一年中的实际气温 变化来确定水温 通常情况下 冬季 春季 秋季和夏季可分别选取 5 15 25 和 35 的水温 因为这 4 个水温是比较符合实际情况的 对现实也有指导意义 2 洗涤方式和材料的选择 在洗涤方式中有机洗和手洗两种方式 应考虑其中哪一种比较科学 哪一种更有利于 控制变量 再有 洗衣机又可以分为半自动和全自动两种 相比之下 采用全自动洗衣机 比较好 并且应该尽量使用同一型号小容量的洗衣机 其机械搅拌作用相同 关于洗涤材 料的选择也有一些讲究 用衣物作实验材料并不理想 这是因为作为实验材料的衣物 其 大小 颜色 洁净程度等应该完全一致 而这并不容易做到 此外 人为地在衣物上增加 污物 如血渍 油渍等 也令人难以接受 因此 选用布料作为实验材料比较可行 在作 对照实验时 可以控制布料的大小 颜色以及污物的量 使其相同 同时 也便于洗涤效 果的比较 3 水量 水质和洗衣粉用量的问题 水的用量和布料的大小是成正比的 做实验用的布料不易过大 水量不易过多 但应 该让布料充分浸泡在水中 水量和洗衣粉的用量可以参考下表 实验时可根据表中的数据 换算出实际用量 如果在实验中使用手洗的方法 如课本中图 4 4 所示 使用 1 000 mL 的 烧杯作为容器 可以用 500 mL 的水 洗衣粉的用量可以用 1 g 或 1 5 g 洗涤方式机洗手洗 水量 0 5 L0 5 L 洗衣粉量 0 5 g 1 g 或 1 5 g 其他相关问题简述如下 实验中可以用滴管控制污物的量 待污物干燥后再进行实验 布料应放在洗衣粉溶液中浸泡相同的时间 采用玻璃棒或筷子搅拌的方式模拟洗衣过程 模拟搅拌的时间 次数和力量应基本相同 课题课题 4 4 酵母细胞的固定化酵母细胞的固定化 一 实验原理一 实验原理 1 使用固定化酶技术 将这种酶固定在一种颗粒状的载体上 再将这些酶颗粒装到一个反应柱内 柱子底端装上分布着许多小孔 的筛板 酶颗粒无法通过筛板的小孔 而反应溶液却可以自由出入 生产过程中 将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入 使葡萄糖溶液流 过反应柱 与固定化葡萄糖异构酶接触 转化成果糖 从反应柱的 下端流出 反应柱能连续使用半年 大大降低了生产成本 提高了 果糖的产量和质量 2 固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞 固定在一定空间内的技术 包括包埋法 化学结合法和物理吸附法 一般来说 酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定 而细胞多 采用包埋法固定化 这是因为细胞个大 而酶分子很小 个大的难 以被吸附或结合 而个小的酶容易从包埋材料中漏出 固定化酶优点 使酶既能与反应物接触 又能与产物分离 还可以 被反复利用 固定化细胞优点 成本更低 操作更容易 可以催化一系列的化学反应 用心 爱心 专心5 二 实验步骤二 实验步骤 1 细胞的活化 称取 lg 干酵母 放入 50 mL 的小烧杯中 加人蒸馏水 10 mL 用玻璃棒搅拌 使酵母 细胞混合均匀 成糊状 放置 1h 左右 使其活化 注 活化 让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态 2 配制物质的量浓度为 0 05mo1 L 的 CaCl2溶液 称取无水 CaCl2 0 83g 放人 200mL 的烧杯中 加入 150mL 的蒸馏水 使其充分溶解 待用 3 配制海藻酸钠溶液 称取 0 7g 海藻酸钠 放入 50mL 小烧杯中 加人 10mL 水 用酒精灯加热 边加热边搅 拌 将海藻酸钠调成糊状 直至完全溶化 用蒸馏水定容至 10 mL 注意 加热时要用小 火 或者间断加热 反复几次 直到海藻酸钠溶化为止 4 海藻酸钠溶液与酵母细胞混合 将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温 加人已活化的醉母细胞 进行充分搅拌 使其 混合均匀 再转移至注射器中 注 冷却至室温的目的 防止杀死酵母菌 5 固定化酵母细胞 以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的 CaCl2溶液中 观察液滴在 CaCl2溶液中形成凝胶珠的情形 将这些凝胶珠在 CaCl2溶液中浸泡 30 min 左右 注 CaCl2溶液的作用 使胶体聚沉 6 使用固定化酵母细胞发酵 将固定好的酵母细胞 凝胶珠 用蒸馏水冲洗 2 3 次 将 150mL 质量分数为 10 的葡萄糖溶液转移到 200mL 的锥形瓶中 再加入固定好的 酵母细胞 置于 25 下发酵 24h 三 注意事项三 注意事项 1 配制海藻酸钠溶液 小火 间断加热 定容 如果加热太快 海藻酸钠会发生焦糊 2 海藻酸钠溶液与酶母细胞混合 冷却后再混合 注意混合均匀 不要进入气泡 3 制备固定化酵母细胞 高度适宜 并匀速滴入 4 刚形成的凝胶珠应在 CaCL2溶液中浸泡一段时间 以便 Ca2 与 Na 充分交换 形成 的凝胶珠稳定 检验凝胶珠是否形成 可用下列方法 用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌 上用手挤压 如果不容易破裂 没有液体流出就表明成功地制成了凝胶珠 还可以用手将 凝胶珠在实验桌上用力摔打 如果凝胶珠很容易弹起 也表明制备的凝胶珠是成功的 5 凝胶珠的颜色和形状 如果制作的凝胶珠颜色过浅 呈白色 说明海藻酸钠的浓度偏低 固定的酵母细胞数 目较少 如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形 则说明海藻酸钠的浓度偏高 制作失败 需要再作尝试 课题课题 5 5 DNADNA 的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定 一 实验原理一 实验原理 提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性 用心 爱心 专心6 质的生物大分子 对于 DNA 的粗提取而言 就是要利用 DNA 与 RNA 蛋白质和脂质等在物 理和化学性质方面的差异 提取 DNA 去除其他成分 1 DNA 的溶解性 DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度不同 利用这一特点 选择 适当的盐浓度就能使 DNA 充分溶解 而使杂质沉淀 或者相反 以达到分离目的 此外 DNA 不溶于酒精溶液 但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精 利用这一原理 可以将 DNA 与蛋白质进一步的分离 2 DNA 对酶 高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解蛋白质 但是对 DNA 没有影响 大多数蛋白质不能忍受 60 80oC 的高温 而 DNA 在 80oC 以上才会变性 洗涤剂能够瓦解细胞膜 但对 DNA 没有影响 3 DNA 的鉴定 在沸水浴条件下 DNA 遇二苯胺会被染成蓝色 因此二苯胺可以作为鉴定 DNA 的试剂 二 实验设计二 实验设计 1 1 实验材料的选取 实验材料的选取 凡是含有 DNA 的生物材料都可以考虑 但是使用 DNA 含量相对较高的生物组织 成功 的可能性更大 2 2 破碎细胞 获取含 破碎细胞 获取含 DNADNA 的滤液的滤液 动物细胞的破碎比较容易 以鸡血细胞为例 在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 同时用玻璃棒搅拌 过滤后收集滤液即可 如果实验材料是植物细胞 需要先用洗涤剂溶 解细胞膜 例如 提取洋葱的 DNA 时 在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐 进行充 分的搅拌和研磨 过滤后收集研磨液 注意 为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体 水分可以大量进入血细胞内 使血细胞胀 裂 再加上搅拌的机械作用 就加速了鸡血细胞的破裂 细胞膜和核膜的破裂 从而释 放出 DNA 加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么 洗涤剂是一些离子去污剂 能溶解细胞膜 有利于 DNA 的释放 食盐的主要成分是 NaCl 有利于 DNA 的溶解 如果研磨不充分 会对实验结果产生怎样的影响 研磨不充分会使细胞核内的 DNA 释放不完全 提取的 DNA 量变少 影响实验结果 导 致看不到丝状沉淀物 用二苯胺鉴定不显示蓝色等 此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分 可能含有核蛋白 多糖和 RNA 等杂质 3 3 去除滤液中的杂质 去除滤液中的杂质 方案一的原理是 DNA 在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度不同 方案二的原理是蛋白酶分解 蛋白质 不分解 DNA 方案三的原理是蛋白质和 DNA 的变性温度不同 注意 为什么反复地溶解与析出 DNA 能够去除杂质 用高盐浓度的溶液溶解 DNA 能除去在高盐中不能溶解的杂质 用低盐浓度使 DNA 析 出 能除去溶解在低盐溶液中的杂质 因此 通过反复溶解与析出 DNA 就能够除去与 DNA 溶解度不同的多种杂质 方案二与方案三的原理有什么不同 用心 爱心 专心7 方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白 从而使提取的 DNA 与蛋白质分开 方案三利用的 是 DNA 和蛋白质对高温耐受性的不同 从而使蛋白质变性 与 DNA 分离 4 4 DNADNA 的析出与鉴定的析出与鉴定 将处理后的溶液过滤 加入与滤液体积相等 冷却的酒精溶液 静置 2 3min 溶液 中会出现白色丝状物 这就是粗提取的 DNA 用玻璃棒沿一个方向搅拌 卷起丝状物 并 用滤纸吸取上面的水分 取两支 20ml 的试管 各加入物质的量浓度为 2mol L 的 NaCl 溶液 5ml 将丝状物放入 其中一支试管中 用玻璃棒搅拌 使丝状物溶解 然后 向两支试管中各加入 4ml 的二苯 胺试剂 混合均匀后 将试管置于沸水中加热 5min 待试管冷却后 比较两支试管溶液颜 色的变化 看看溶解有 DNA 的溶液是否变蓝 三 实验步骤三 实验步骤 以洋葱为实验材料以洋葱为实验材料 1 称取 30 克已切碎的洋葱 放入研钵中 加入少量石英砂助研 倒入 10mL 2mol L 的氯化钠溶液 充分研磨 洋葱含有挥发性刺激物 有效减少刺激 才能使实验顺利进行 上课前 教师可先将 洋葱放入冰箱冷冻一会儿 使其凉透但又不能结冰 或将洋葱切成几大块 放入清水泡一 会儿 让其挥发性刺激物溶于水 可以减轻刺激 然后将洋葱切碎备用 研磨的目的主要 是使洋葱细胞破裂 使 DNA 溶于 2mol L 的氯化钠溶液 没必要将洋葱研成粥糊状 后者既 浪费时间又影响实验效果 研磨时 切忌使用搅拌器 榨汁机 使用搅拌器虽可以提高研 磨效率 但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒 无法通过过滤将洋葱颗粒剔除 只能将酒精 直接倒入滤液中 许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来 DNA 藏在其中 无法分辨 学生看 不到白色纤维状粘稠物的 DNA 2 研磨后 用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中 得到滤液 3 向滤液中加入 95 的酒精溶液 20mL 沿烧杯壁缓缓倒入 不要震动或搅拌 此时 烧杯中的液体分为上 下两层 下层较浑浊 上层澄清 很快上层溶液中就会 有白色纤维状粘稠物析出 用玻璃棒可将其轻轻卷起 这就是记录生命遗传信息的重要物 质 DNA DNA 析出的过程中 切忌震动和搅拌 不震动易于分层 我们就能很容易观察 到上清液中的丝状物 搅拌会使非常柔软的 DNA 断裂成小段 不易取出 如果用玻璃棒 DNA 不易卷起 可改用表面打毛的牙签 DNA 提取物就缠绕在牙签上了 4 鉴定 取两支试管 编为 1 2 号 各加入 2mol L 的氯化钠溶液 2mL 向 1 号试管 中加入一些白色纤维状物 振荡使其溶解 然后向两支试管中各加入 2mL 二苯胺试剂 沸 水浴加热 5 分钟 四 注意事项四 注意事项 1 以血液为实验材料时 每 100ml 血液中需要加入 3g 柠檬酸钠防止血液凝固 2 加入洗涤剂后 动作要轻缓 柔和 否则容易产生大量的泡沫 不利于后续步骤地 操作 加入酒精和用玻璃棒搅拌时 动作要轻缓 以免 DNA 分子的断裂 导致 DNA 分子不 能形成絮状沉淀 3 二苯胺试剂要现配现用 否则会影响鉴定的效果 4 DNA 的溶解度与 NaCl 溶液浓度的关系 当 NaCl 溶液浓度低于 0 14mol L 时 随浓度的升高 DNA 的溶解度降低 当 NaCl 溶 液浓度高于 0 14mol L 时 随浓度升高 DNA 的溶解度升高 5 盛放鸡血细胞液的容器 最好是塑料容器 鸡血细胞破碎以后释放出的 DNA 容易被玻璃容器吸附 由于细胞内 DNA 的含量本来 就比较少 再被玻璃容器吸附去一部分 提取到的 DNA 就会更少 因此 实验过程中最好 使用塑料的烧杯和试管 这样可以减少提取过程的 DNA 的损失 用心 爱心 专心8 课题课题 6 6 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离 一 实验原理一 实验原理 蛋白质的物化理性质 形状 大小 电荷性质和多少 溶解度 吸附性质 亲和力等 千差万别 由此提取和分离各种蛋白质 1 1 凝胶色谱法 分配色谱法 凝胶色谱法 分配色谱法 原理 分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙 路程短 流动快 分子量小的分 子穿过多孔凝胶颗粒内部 路程长 流动慢 凝胶材料 多孔性 多糖类化合物 如葡聚糖 琼脂糖 分离过程 混合物上柱 洗脱 大分子流动快 小分子流动慢 收集大分子 收集小分子 洗脱 从色谱柱上端不断注入缓冲液 促使蛋白质分子的差速流动 作用 分离蛋白质 测定生物大分子分子量 蛋白质的脱盐等 2 2 缓冲溶液 缓冲溶液 原理 由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成 如 H2CO3 NaHCO3 NaH2PO4 Na2HPO4等 调节酸和盐的用量 可配制不同 pH 的缓冲液 缓冲液作用 抵制外界酸 碱对溶液 pH 的干扰而保持 pH 稳定 3 3 凝胶电泳法 凝胶电泳法 原理 不同蛋白质的带电性质 电量 形状和大小不同 在电场中受到的作用力大 小 方向 阻力不同 导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同 分离方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳等 分离过程 在一定 pH 下 使蛋白质基团带上正电或负电 加入带负电荷多的 SDS 形成 蛋白质 SDS 复合物 使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小 二 实验步骤二 实验步骤 1 1 样品处理 样品处理 红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白 采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞 然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆 将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯 再加入 五倍体积的生理盐水 缓慢搅拌 10min 低速短时间离心 如此重复洗涤三次 直至上清 液中没有黄色 表明红细胞已洗涤干净 血红蛋白的释放 在蒸馏水和甲苯作用下 红细胞破裂释放出血红蛋白 注 加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同 加入甲苯的目的是溶解细胞膜 有利于血红蛋白的释放和分离 2 2 粗分离 粗分离 分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后 试管中的溶液分为 4 层 第一层为无色透明的甲苯层 第 2 层为白色薄层固体 是脂溶性物质的沉淀层 第 3 层是红色透明液体 这是血红蛋白 的水溶液 第 4 层是其他杂质的暗红色沉淀物 将试管中的液体用滤纸过滤 除去之溶性 沉淀层 于分液漏斗中静置片刻后 分出下层的红色透明液体 用心 爱心 专心9 透析 取 1mL 的血红蛋白溶液装入透析袋中 将透析袋放入盛有 300mL 的物质的量的浓度为 20mmol L 的磷酸缓冲液中 透析 12h 透析可以去除样品中分子量较小的杂质 或用于更 换样品的缓冲液 3 3 纯化 纯化 调节缓冲液面 调节缓冲液面 打开色谱柱下端的流出口 使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝 胶面平齐 关闭出口 加入蛋白质样品 加入蛋白质样品 用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端 加样后 打开下端出口 使样品渗入凝胶床内 等样品完全渗入凝胶层后 关闭出口 调节缓冲液面 调节缓冲液面 加入 20mmol L 的磷酸缓冲液到适当高度 洗脱 洗脱 连接缓冲液洗脱瓶 打开下端出口 进行洗脱 收集分装蛋白质 收集分装蛋白质 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时 用试管收集 4 4 纯度鉴定 纯度鉴定 SDS 聚丙烯酰胺凝